基于固態(tài)納米孔基因測序的關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、基因測序技術(shù)不僅為遺傳信息的揭示和基因表達(dá)調(diào)控等基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供重要數(shù)據(jù)，而且在基因診斷和基因治療等應(yīng)用研究中也發(fā)揮著重要的作用。自從1977年第一代測序技術(shù)問世以來，經(jīng)過三十幾年的努力，基因測序技術(shù)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，在第一代和第二代測序技術(shù)的基礎(chǔ)上，以單分子測序?yàn)樘攸c(diǎn)的下一代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。納米孔測序技術(shù)被認(rèn)為是最有可能成為下一代基因測序的技術(shù)之一，它不僅有可能將目前的DNA序列分析的成本大大降低，分析速度大大提高，還將推進(jìn)基于

2、基因組技術(shù)的個(gè)性化醫(yī)學(xué)向現(xiàn)實(shí)邁進(jìn)一步，從而引起醫(yī)學(xué)界的一次變革。
　　本文以下一代基因測序的納米檢測傳感器的設(shè)計(jì)理論、制造工藝和生物分子辨識(shí)為研究內(nèi)容，開展了微納制造方面器件結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和納通道內(nèi)的離子輸運(yùn)基礎(chǔ)理論的研究工作，搭建了生物分子檢測平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對生物大分子的檢測。取得創(chuàng)新研究成果如下:
　　(1)在納米孔制備方面實(shí)現(xiàn)了三種不同基底材料納米通道的研制?；诠杌牧系募庸し椒?，結(jié)合聚焦離子束(FIB)以及透射電子顯微鏡(

3、TEM)高能離子束和電子束制造技術(shù)，提出對氮化硅基底進(jìn)行先減薄后濺射的加工工藝，成功研制出孔徑小于5nm的三維納米孔，總結(jié)工藝參數(shù)對納米孔加工質(zhì)量、幾何結(jié)構(gòu)和幾何參數(shù)的影響規(guī)律。利用低壓氣相沉積技術(shù)實(shí)現(xiàn)了大面積的石墨烯薄膜制備并且成功實(shí)現(xiàn)石墨烯薄膜的轉(zhuǎn)移，對石墨烯在高能電子束輻照下的熱力學(xué)響應(yīng)過程進(jìn)行了系統(tǒng)研究，提出一種新穎的石墨烯納米孔加工工藝，成功制備出孔徑可以控制在單位納米精度的石墨烯納米孔。在納米通道制備方面利用包埋氧化聚乙烯(

4、PEO)納米纖維的方法成功制備出長度在毫米，孔徑卻在數(shù)十納米的聚二甲基硅氧烷(PDMS)納米通道。
　　(2)針對基于納通道的納流體傳感器的流體輸運(yùn)特性，進(jìn)行電解質(zhì)溶液在納米受限空間下的流變行為研究，開展了離子在納通道內(nèi)輸運(yùn)的基礎(chǔ)理論研究工作。對氯化鈉(NaCl)溶液在納米通道內(nèi)的電導(dǎo)率進(jìn)行了從低到高不同濃度的測量，在國際上，最先完成了納米通道內(nèi)高濃度的電解質(zhì)溶液中離子輸運(yùn)的數(shù)據(jù)的測量。提出在低濃度時(shí)納米孔的電導(dǎo)率主要由孔內(nèi)的電荷

5、密度所決定，而在高濃度且當(dāng)孔徑小到4.5nm時(shí)，其電導(dǎo)率偏離體態(tài)電導(dǎo)率的行為，并通過分子動(dòng)力學(xué)模型對納米孔內(nèi)離子輸運(yùn)特性進(jìn)行了深入分析研究，對納米通道內(nèi)離子輸運(yùn)特性異于體態(tài)特性給出了全新的解釋。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PDMS納米通道內(nèi)電導(dǎo)率會(huì)隨著電解質(zhì)溶液溶度不斷提高而下降的現(xiàn)象，即在納米通道內(nèi)隨著溶液濃度的提高，離子遷移率的下降導(dǎo)致其電導(dǎo)率隨電解質(zhì)溶液濃度上升而下降現(xiàn)象。通過對納米孔進(jìn)行親水處理與疏水處理的對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過親水處理后可以大大改善納

6、米孔的整流效應(yīng)，這一結(jié)果有效地提高DNA檢測時(shí)DNA分子的捕獲率。
　　(3)根據(jù)納米孔內(nèi)噪音類型以及噪音來源的理論分析，對硅基納米孔基底材料分別進(jìn)行涂覆PDMS、親水處理以及沉積氧化鋁等不同方法對納米孔進(jìn)行了表面修飾，大大地降低了納米孔基準(zhǔn)電流噪音信號，有效地提高了納米孔檢測DNA分子過孔信號的信噪比。
　　(4)實(shí)現(xiàn)納米孔與檢測平臺(tái)之間的集成，搭建了納米孔生物分子檢測的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，并且通過該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)成功實(shí)現(xiàn)對48kbλDN

7、A過孔姿態(tài)的識(shí)別，根據(jù)生物分子過孔時(shí)誘導(dǎo)的離子電流變化量以及電流信號持續(xù)的時(shí)間這兩個(gè)特征量，分析不同形態(tài)的過孔信號特征實(shí)現(xiàn)單分子的過孔姿態(tài)的識(shí)別，并對DNA過孔時(shí)引起的阻塞電流信號進(jìn)行理論推導(dǎo)，對DNA過孔時(shí)間的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過對納米孔壁面進(jìn)行修飾有效地實(shí)現(xiàn)DNA過孔速度的降低。在納米孔孔徑縮小至2.5nm時(shí)成功對三堿基單鏈聚合分子GGG與TTT進(jìn)行識(shí)別，為單堿基檢測提供了可靠的參考數(shù)據(jù)。同時(shí)在石墨烯納米孔檢測DNA研究中，