草甘膦跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制研究.pdf

1、草甘膦是1973年上市使用的一種廣譜除草劑。許多文獻(xiàn)報(bào)道草甘膦能對機(jī)體各組織產(chǎn)生一定的毒性，引發(fā)心臟功能不全者發(fā)生心律不齊等現(xiàn)象，引起中老年人產(chǎn)生諸如阿爾茨海默病、帕金森病等腦部退行性疾病。草甘膦通常采取噴灑施用，因此它可以通過呼吸系統(tǒng)由鼻腔進(jìn)入到人體血液循環(huán)系統(tǒng)后到達(dá)體內(nèi)各組織。由于人體鼻腔存在鼻腦通路，草甘膦亦有可能經(jīng)此這條通路直接從鼻腔進(jìn)入腦部，直接引發(fā)其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用。許多內(nèi)源性或外源性化學(xué)物質(zhì)在人體內(nèi)的藥動學(xué)過程均與

2、體內(nèi)廣泛存在的轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鼻黏膜組織上存在大量轉(zhuǎn)運(yùn)體。其中，有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OCT)、P-糖蛋白外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（P-gp）以及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體等在小鼠、大鼠、牛、人鼻黏膜內(nèi)均有表達(dá)?？紤]到草甘膦的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的極性，與氨基酸結(jié)構(gòu)很相似，提示草甘膦可能通過鼻黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)鼻腦通路直接進(jìn)入腦內(nèi)，使其所引起的毒性遠(yuǎn)大于經(jīng)呼吸、吞咽等方式進(jìn)入體循環(huán)過程所引起的毒性。本文主要研究氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在草甘膦跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用

3、，并分析草甘膦通過鼻腦通路途徑進(jìn)入到腦部而產(chǎn)生毒副作用的可能性。
　　為了檢測不同生物樣品中的草甘膦濃度，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道建立了草甘膦的氣相色譜-氫焰離子(GC-FID)和液相色譜-熒光(HPLC-FD)的檢測方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。GC-FID采用三氟乙酸酐（TFAA）和三氟乙醇（TFE）對草甘膦進(jìn)行柱前衍生，使用Agilent? HP-1氣相色譜柱進(jìn)行檢測，并采用內(nèi)標(biāo)法，樣品出峰時間為5.72 min，內(nèi)標(biāo)出峰時間為11

4、.56 min，分析時長為24 min；HPLC-FD采用芴酰氯(FMOC-Cl)對草甘膦進(jìn)行柱前衍生，使用Thermo? C18色譜柱進(jìn)行檢測，采用外標(biāo)法，樣品出峰時間為7.30 min，分析時長為20 min；二者的分析時長均保證了高通量樣品分析。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，GC-FID檢測條件下，在10-800μg?mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，r>0.99；HPLC-FID檢測條件下，在5-800 ng?mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)

5、良好的線性關(guān)系，r>0.99，符合生物樣品測定要求。兩種分析方法條件下，草甘膦均具有良好的峰型，高、中、低三個濃度下日內(nèi)、日間精密度均小于13.66％，不同條件下的穩(wěn)定性偏差在±15%以內(nèi)，準(zhǔn)確性亦符合生物樣品測定的要求，表明此兩種檢測方法準(zhǔn)確靈敏，能夠?qū)Ω鞣N生物基質(zhì)中的草甘膦進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
　　為了考察草甘膦跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的特性，本文選取了與人鼻黏膜結(jié)構(gòu)極其相似的牛鼻黏膜在擴(kuò)散池模型上對草甘膦跨牛鼻黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行研究。分別采用牛呼

6、吸黏膜與嗅黏膜進(jìn)行草甘膦跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，并考察2,4-DNP（ATP阻斷劑）對草甘膦的轉(zhuǎn)運(yùn)過程的影響，根據(jù)測定實(shí)驗(yàn)前后跨膜電阻值（TEER）的變化以及冷凍切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析實(shí)驗(yàn)過程對牛鼻黏膜完整性的影響。結(jié)果表明草甘膦在牛鼻黏膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)屬于非能量依賴型，可能是由主動轉(zhuǎn)運(yùn)和被動擴(kuò)散共同參與的過程（呼吸黏膜中Km值為1.002±0.374μg·mL-1，Vmax值為0.1283±0.016μg·cm-2·min-1；嗅黏膜中Km值為0.371

7、±0.050μg·mL-1，Vmax值為0.0163±0.005μg·cm-2·min-1）。牛鼻黏膜在實(shí)驗(yàn)過程中跨膜電阻值沒有發(fā)生明顯變化（實(shí)驗(yàn)前后TEER值均大于100Ω?cm2），切片觀察未發(fā)現(xiàn)損傷。根據(jù)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體家族中各亞型的底物選擇性以及Na+依賴性的不同，考察不同種類氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性底物以及抑制劑對草甘膦跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明草甘膦跨鼻黏膜的轉(zhuǎn)運(yùn)屬于Na+非依賴型；經(jīng)典的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體底物（L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、

8、L-丙氨酸）與抑制劑（BCH等）均能顯著抑制草甘膦的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。考慮到實(shí)驗(yàn)過程中，轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的變化也可能影響草甘膦的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，采用Western Blot方法測定牛鼻黏膜上的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示牛鼻黏膜上表達(dá)的L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量未受到底物草甘膦或抑制劑的影響，表明草甘膦跨鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率下降是與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體底物發(fā)生了競爭性抑制。
　　為了進(jìn)一步探索草甘膦轉(zhuǎn)運(yùn)過程涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)體，選用廣泛表達(dá)各類轉(zhuǎn)運(yùn)體的Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行

9、草甘膦跨膜攝取研究。Caco-2細(xì)胞通常被用于人體小腸吸收模型的研究，其表面表達(dá)多種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，是研究氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的常見模型之一。本文考察了草甘膦轉(zhuǎn)運(yùn)的時間依賴型和濃度依賴型特征。結(jié)果表明草甘膦在隨濃度或時間變化的過程中，其攝取速率首先呈線性變化，但在達(dá)到某一濃度/時間后，開始趨于飽和狀態(tài)，與前述跨牛鼻黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示草甘膦的Caco-2細(xì)胞攝取存在主動轉(zhuǎn)運(yùn)過程（Km=461±168μM,Vmax=166±26 ng·mL-

10、1·mg-1 protein）。為了進(jìn)一步考察草甘膦攝取過程中可能涉及的轉(zhuǎn)運(yùn)體，分別采用含有Na+不含有Na+的緩沖液對其進(jìn)行研究，結(jié)果表明Caco-2細(xì)胞對草甘膦的攝取并不受Na+影響。選取了不同類型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物或抑制劑，對草甘膦的攝取過程進(jìn)行進(jìn)一步的研究，結(jié)果表明不同類型的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體底物，尤其是L系統(tǒng)底物抑制了草甘膦的攝取速率，說明L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體底物可能對草甘膦的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)存在競爭性抑制作用。
　　氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在Ca

11、co-2細(xì)胞兩側(cè)均有表達(dá)，為了明確兩側(cè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在草甘膦轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用，采用經(jīng)典的Transwell?細(xì)胞小室培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞單層膜的方法研究草甘膦的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性。結(jié)果顯示草甘膦自A側(cè)到B側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)速率要高于B側(cè)到A側(cè)，提示其轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能有轉(zhuǎn)運(yùn)體參與。根據(jù)不同類型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在Caco-2細(xì)胞表達(dá)部位的差異，分別選取氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體底物（L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸）和抑制劑（BCH）從不同的轉(zhuǎn)運(yùn)方向考察其對草甘膦

12、轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體L系統(tǒng)底物或抑制劑均能顯著抑制草甘膦的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，推測草甘膦的轉(zhuǎn)運(yùn)過程主要與L系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)。但存在于A側(cè)的y+系統(tǒng)底物（L-賴氨酸）未對草甘膦的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生影響（n=4，p<0.05），位于B側(cè)的b0，+系統(tǒng)屬于Na+依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)體，也未參與草甘膦的轉(zhuǎn)運(yùn)。草甘膦屬于甘氨酸衍生物，此外還考察了不含磷酸根離子的HEPES溶液對草甘膦轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，結(jié)果表明依賴Na+離子和PO4-離子的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體未參與草甘膦的攝取

13、過程（n=4，p<0.05）?？紤]到草甘膦轉(zhuǎn)運(yùn)速率下降的多種原因，進(jìn)一步采用熒光實(shí)時定量PCR與Western Blot方法，對Caco-2細(xì)胞上LAT1/2轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測定。結(jié)果表明在基因和蛋白水平，LAT1/2的表達(dá)量均未發(fā)生顯著變化（p<0.05），提示草甘膦以及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體底物或抑制劑均不影響氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體LAT1/2的表達(dá)，草甘膦跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率的下降可能由于與底物發(fā)生了競爭性抑制。
　　為了判斷草甘膦能

14、否通過鼻腦通路進(jìn)入腦部，選取KM小鼠鼻腔給藥方法，分別對草甘膦原料藥組、草甘膦原料藥與L-丙氨酸合用組以及市售Roundup?劑型組進(jìn)行草甘膦經(jīng)鼻給藥后腦部藥動學(xué)研究，采用DAS?3.0藥動學(xué)軟件進(jìn)行藥動學(xué)參數(shù)計(jì)算。結(jié)果表明，市售劑型組到達(dá)腦部的藥物量遠(yuǎn)大于草甘膦原料藥組進(jìn)入腦部的藥物量，LAT2特異性底物L(fēng)-丙氨酸能顯著抑制其進(jìn)入腦部的量。L系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)體在鼻腔黏膜上均有表達(dá)，推測L系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可能參與了草甘膦經(jīng)鼻入腦的過程，提示草甘