鈦銀合金納米管抗菌性和生物相容性的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　為了同時(shí)滿足抗菌性以及生物相容性的要求，本文制備了具有不同銀含量的新型生物材料“鈦銀合金納米管”，通過與純鈦以及鈦納米管進(jìn)行對比，明確鈦銀合金納米管的抗菌性以及生物相容性，并探究不同的銀含量對其生物學(xué)性能的影響。
　　方法：
　　首先通過陽極氧化技術(shù)制備鈦銀合金納米管，利用掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、X射線衍射分析(XRD)、能譜分析(EDS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)以及

2、電化學(xué)實(shí)驗(yàn)(Electricalchemical Test)，分別對鈦銀合金納米管的表面形貌、表面粗糙度、內(nèi)部晶型結(jié)構(gòu)、內(nèi)部元素含量及分布，銀離子釋放以及樣品耐腐蝕能力進(jìn)行分析。然后，在鈦銀合金納米管表面種植金黃色葡萄球菌并培養(yǎng)24小時(shí)，之后利用SEM觀察細(xì)菌的粘附率;再通過SYTO9/PI活、死細(xì)菌染色，在激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察細(xì)菌活性。同時(shí)，將樣品在PBS中浸泡30天，而后利用平板涂布實(shí)驗(yàn)和抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)觀察鈦銀合金納米管的

3、長期抗菌性以及殺菌方式。在生物相容性評價(jià)實(shí)驗(yàn)中，于鈦銀合金納米管表面種植人骨肉瘤細(xì)胞MG63，利用SEM觀察24小時(shí)后的細(xì)胞粘附率以及細(xì)胞形態(tài);通過Calcein-AM/PI活、死細(xì)胞染色，在激光共聚焦顯微鏡(CLSM)下觀察共培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞活性;將MG63細(xì)胞在各樣品表面培養(yǎng)1、3、5天，利用CCK-8方法對細(xì)胞活性進(jìn)行定量分析;將MG63細(xì)胞在各樣品表面培養(yǎng)1、4、7天，利用（PI單染）流式細(xì)胞分析儀分析其細(xì)胞周期，計(jì)算相應(yīng)的

4、增值分?jǐn)?shù)(PI proliferation index)并判斷各樣品表面細(xì)胞的增值情況;將MG63細(xì)胞在各樣品表面培養(yǎng)3、5、7天，分析其ALP含量并比較各樣品表面的細(xì)胞分化情況;將MG63細(xì)胞在各樣品表面培養(yǎng)1、4、7天，利用(Annexin-Ⅴ/PI雙染)流式細(xì)胞分析儀分析其凋亡情況，并比較各樣品對于細(xì)胞凋亡的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將各材料植入SD大鼠股骨內(nèi)并觀察1、2、4周，而后利用Micro-CT以及H&E染色法比較不同樣品周圍的

5、骨總量，同時(shí)，利用免疫組化法檢測樣品周圍骨組織中BMP-2蛋白的表達(dá)量，判斷不同材料對周圍組織成骨分化能力的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)利用陽極氧化技術(shù)，在鈦銀合金表面成功制備出了表面結(jié)構(gòu)均勻、與基底牢固相連、開口向外的叢林狀的納米管陣列，其直徑為20nm。與光滑鈦(cp-Ti)進(jìn)行對比，可見鈦納米管(TNT)、1％鈦銀合金納米管(Ti1％Ag-NT)、2％鈦銀合金納米管(Ti2％Ag-NT)以及4％鈦銀合金納米管(Ti4

6、％Ag-NT)擁有更高的表面粗糙度。在光滑鈦內(nèi)部，只有Ti晶體;在鈦納米管內(nèi)部，可見Ti以及TiO2兩種晶體;而在鈦銀合金納米管樣品中，除了Ti和TiO2外，還可見到TiAg以及Ag2O晶體。在能譜分析中，鈦銀合金納米管內(nèi)實(shí)際的銀含量分別是：1％鈦銀合金納米管為0.9wt％，2％鈦銀合金納米管為1.96wt％，4％鈦銀合金納米管3.91wt％，鈦、銀、氧三種元素均勻的分布在鈦銀合金納米管材料表面。在離子釋放實(shí)驗(yàn)中，從鈦銀合金納米管的浸提

7、液中未能檢測到游離的銀離子;電化學(xué)實(shí)驗(yàn)證明鈦銀合金納米管表面發(fā)生了明顯的腐蝕反應(yīng)，鈦銀合金納米管的抗腐蝕能力弱于光滑鈦。
　　(2)鈦銀合金納米管的抗菌性（長、短期）顯著優(yōu)于純鈦以及鈦納米管。鈦銀合金納米管不僅可以明顯抑制金黃色葡萄球菌的粘附，也可以將絕大部分粘附的細(xì)菌殺滅。鈦銀合金納米管具有良好的長期抗菌性，浸泡一個(gè)月后，其抗菌性仍能達(dá)到：1％鈦銀合金納米管為95％±2.5％，2％鈦銀合金納米管為98％±1％，4％鈦銀合金納米管

8、為91％±2.1％。但在鈦銀合金納米管周圍未發(fā)現(xiàn)抑菌環(huán)。
　　(3)雖然鈦銀合金納米管的生物相容性顯著低于鈦納米管(P＜0.05)，但與光滑鈦對比時(shí)，2％鈦銀合金納米管的生物相容性仍是令人滿意的。其中，2％鈦銀合金納米管表面的細(xì)胞粘附、形態(tài)、早期分化以及抑制細(xì)胞凋亡的能力與光滑鈦相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);同時(shí)2％鈦銀合金納米管表面的細(xì)胞活性以及增值能力明顯優(yōu)于光滑鈦(P＜0.05);而1％和4％鈦銀合金納米管的生物相容性則

9、弱于光滑鈦(P＜0.05);鈦銀合金納米管的生物相容性受銀含量的影響，體外生物相容性優(yōu)劣的順序是：2％鈦銀合金納米管＞4％鈦銀合金納米管＞1％鈦銀合金納米管。在體內(nèi)試驗(yàn)中，Micro-CT證明1周以及4周時(shí)（1％，2％和4％）鈦銀合金納米管周圍的骨總量與光滑鈦無顯著差異(P＞0.05)，但在2周時(shí)，2％和4％鈦銀合金納米管要顯著高于光滑鈦(P＜0.05);在HE實(shí)驗(yàn)中，1、2、4周時(shí)2％以及4％鈦銀合金納米管周圍的骨量與光滑鈦之間均無明

10、顯差異(P＞0.05)，而1％鈦銀合金納米管在4周時(shí)的周圍骨量顯著低于光滑鈦(P＜0.05);在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，1周時(shí)1％鈦銀合金納米管周圍BMP-2的表達(dá)量與光滑鈦之間無差異(P＞0.05)，但2％和4％鈦銀合金納米管則顯著高于光滑鈦（P＜0.05）;在2周時(shí)，1％鈦銀合金納米管周圍BMP-2的表達(dá)量顯著低于光滑鈦(P＜0.05)，而2％和4％鈦銀合金納米管則顯著高于光滑鈦(P＜0.05);在4周時(shí)，1％鈦銀合金納米管周圍BMP-2的

11、表達(dá)量顯著低于光滑鈦(P＜0.05)，但2％和4％鈦銀合金納米管與光滑鈦之間無差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)陽極氧化技術(shù)可以在鈦銀合金表面制備鈦銀合金納米管，并控制其表面形貌和結(jié)構(gòu)參數(shù);(2)鈦銀合金納米管具有優(yōu)異的長期、短期抗菌性，可以有效抑制菌膜形成，其中2％鈦銀合金納米管的抗菌性最強(qiáng);(3)鈦銀合金納米管的生物相容性受銀含量的影響，2％鈦銀合金納米管的生物相容性與光滑鈦相似，無細(xì)胞毒性;(4)2％鈦銀合