脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對雞軟骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON),又名嘔吐毒素(vomitoxin),是由鐮刀菌屬病原真菌產(chǎn)生的真菌毒素之一。研究報道DON具有很強的細(xì)胞毒性,對于原核細(xì)胞、真核細(xì)胞均具有明顯的毒性作用,DON可抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本試驗選用雞軟骨細(xì)胞為研究對象,觀察體外培養(yǎng)的雞軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；在DON不同濃度梯度作用和不同培養(yǎng)時間作用下,觀察DON對雞軟骨細(xì)胞增殖和分化的影響；研究DON對雞軟骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)凋亡因子c

2、aspase-3、C-myc和P53 mRNA的表達(dá)的影響,為深入研究DON的細(xì)胞毒性分子機制提供依據(jù)。
　　 試驗Ⅰ雞軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及DON對體外培養(yǎng)的雞軟骨細(xì)胞增殖與分化的影響目的:探討17日齡雞胚軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)生長規(guī)律及DON對其增殖與分化的影響。方法:設(shè)計以1 mg·mL-1的Ⅳ型膠原酶進(jìn)行消化,分離制備軟骨細(xì)胞,透射電子顯微鏡和倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性及生長狀況。添加不同濃度的DON

3、,通過MTT法測定細(xì)胞增殖率,PNPP法測定軟骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性,倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果:(1)透射電子顯微鏡下可觀察到軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特征,倒置相差顯微鏡下可觀察到軟骨細(xì)胞生長狀況；(2)與對照組相比,10、5、2、1、0.5、0.1、0.02μg·mL-1的DON均顯著抑制軟骨細(xì)胞增殖；(3)與對照組相比,20、80、320 ng·mL-1DON極顯著抑制軟骨細(xì)胞ALP活性；(4)倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)軟骨

4、形態(tài)發(fā)生變化。結(jié)論:雞軟骨細(xì)胞培養(yǎng)成功為下一步研究提供了試驗材料；DON能顯著抑制軟骨細(xì)胞的增殖與分化。
　　 試驗Ⅱ DON對雞軟骨細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響目的:在建立雞軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,研究DON對雞軟骨細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響.方法:以320 ng·mL-1DON添加到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡情況。取軟骨細(xì)胞原代接種于六孔板,添加含5％FBS的DMEM/F12對照組和含不同濃度的DON試驗組,48

5、 h后分別用試劑盒測定雞軟骨細(xì)胞GSH、LDH、SOD活性。結(jié)果:(1)流式檢測凋亡率升高；(2)與對照組相比,20、80、320 ng·mL-1DON均可使細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH、LDH、SOD含量升高。結(jié)論:DON促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。
　　 試驗Ⅲ DON對雞軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響目的:在建立雞軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,研究DON對Caspase-3、C-myc和P53 mRNA表達(dá)的影響.方法:用含20、80,320

6、 ng·mL-1的DON以及含5％FBS的DMEM/F12對照組處理雞軟骨細(xì)胞48 h后,用RT-PCR方法檢測其Caspase-3、C-myc和P53 mRNA表達(dá)量變化。結(jié)果:與對照組相比,20、80、320 ng·mL-1DON可顯著上調(diào)Caspase-3 mRNA的表達(dá)；80、320 ng·mL-1DON作用下C-myc的表達(dá)出現(xiàn)明顯上升；320 ng·mL-1DON可顯著上調(diào)P53 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論:DON可