凝血酶電化學(xué)適體傳感器的研究.pdf

1、凝血酶是一種由凝血酶前體形成的絲氨酸蛋白質(zhì)水解酶，具有催化纖維蛋白元變成纖維蛋白，促進(jìn)血液凝固和調(diào)控凝血等作用，在揭示腫瘤的發(fā)生機(jī)制及作為早期診斷、療效及愈后判斷依據(jù)等方面有著非常重大的意義。由于血液中凝血酶的濃度達(dá)nmol·L-1，建立簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度檢測(cè)凝血酶的方法具有非常重要的意義。將SELEX技術(shù)篩選出的適體作為識(shí)別元件與電化學(xué)生物傳感器相結(jié)合構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器，集成了適體和電化學(xué)傳感器兩方面的優(yōu)勢(shì)，既具有電化學(xué)傳感器的高

2、靈敏度、快響應(yīng)、簡(jiǎn)單操作、低成本，又具有適體的高選擇性和特異性，在凝血酶檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本文的研究目的是構(gòu)建簡(jiǎn)單、可靠、快速、高靈敏度的電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。圍繞本研究目的主要從電化學(xué)適體傳感器敏感界面的構(gòu)建，多功能化復(fù)合納米材料的制備以及新型電化學(xué)信號(hào)放大策略等進(jìn)行了探索和研究。本文分以下幾個(gè)部分組成:
　　 第一章緒論，簡(jiǎn)要對(duì)適體的體外篩選方法、適體的特點(diǎn)、適體與凝血酶的相互作用進(jìn)行了概述。詳細(xì)介紹了

3、電化學(xué)適體傳感器的基本原理和其分類，適體的固定化方法以及相關(guān)的電化學(xué)分析技術(shù)，重點(diǎn)評(píng)述了納米粒子、酶催化、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和目標(biāo)循環(huán)信號(hào)放大技術(shù)在電化學(xué)適體傳感器中的應(yīng)用。最后引出本論文的選題背景、研究意義、研究目的和研究?jī)?nèi)容。
　　 第二章，由于適體本身為非電活性，或者適體中A、G和C堿基的電氧化還原信號(hào)低，且電化學(xué)調(diào)制不利于適體親合性質(zhì)的保持，大部分電化學(xué)適體傳感器都需要功能性標(biāo)記物以得到可定量檢測(cè)的電化學(xué)信息。然而標(biāo)記物的標(biāo)記

4、過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)、成本較高，且標(biāo)記過(guò)程可能會(huì)影響其生物活性?；趯訉幼越M裝技術(shù)在金電極表面組裝了{(lán)nano-Au/Thi}n多層膜，并以此為氧化還原探針和凝血酶適體固載基質(zhì)構(gòu)建了一種signal-off型免標(biāo)記電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。該方法無(wú)需對(duì)適體進(jìn)行電活性物質(zhì)標(biāo)記，一定程度上大大增加了電活性物質(zhì)在電極表面的固載量和減少了電活性物質(zhì)與電極表面的距離，具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。同時(shí)，該適體傳感器的構(gòu)建方法適用于其他各

5、種適體的固載，在蛋白質(zhì)檢測(cè)和疾病診斷等領(lǐng)域都有很廣的應(yīng)用前景。
　　 第三章，G-四鏈體-卟啉鐵(hemin/G-quadruplex)作為酶催化標(biāo)記能有效放大電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。與普通的蛋白酶相比較它更易于標(biāo)記、成本低，穩(wěn)定性好和抗水解性強(qiáng)。利用凝血酶適體富含G堿基能與卟啉鐵hemin結(jié)合形成具有類似辣根過(guò)氧化物酶電催化增強(qiáng)性質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)hemin/G-quadruplex，構(gòu)建了電催化放大信號(hào)的signal-off型電化學(xué)適體傳

6、感器用于凝血酶的檢測(cè)。并首次提出使用HRP封閉電化學(xué)適體傳感器表面的非特異性吸附位點(diǎn)，且同時(shí)催化放大響應(yīng)電流信號(hào)，進(jìn)而提高電化學(xué)適體傳感器的靈敏度的新方法。該傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶高特異性和高靈敏度的識(shí)別，免去了電活性物質(zhì)和酶的標(biāo)記。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，該傳感器構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，切實(shí)可行，大大提高了電化學(xué)適體傳感器的靈敏度。
　　 第四章，金屬納米催化信號(hào)放大與酶相比，其熱穩(wěn)定性有很大的改善。以電惰性物質(zhì)十八酸OCA和具有雙功能的Au-P

7、tNPs電催化雙重放大響應(yīng)信號(hào)制備了目標(biāo)物引起的signal-on型電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。在測(cè)試底液中存在H2O2情況下，Au-PtNPs對(duì)亞甲藍(lán)MB的氧化還原反應(yīng)起到明顯的增強(qiáng)作用。進(jìn)行定量分析時(shí)，傳感器表面阻礙電子傳輸?shù)氖怂酧CA修飾的凝血酶適體捕獲目標(biāo)分子后離開(kāi)電極表面，電極表面空間位阻減少，同時(shí)Au-PtNPs的催化活性增加，使所得的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)一步增加，從而有效地提高了電極靈敏度。該適體傳感器構(gòu)建方法簡(jiǎn)單、響應(yīng)快、

8、靈敏度高、穩(wěn)定性好，將其用于臨床樣品檢測(cè)，得到滿意結(jié)果。
　　 第五章，通過(guò)π-π堆垛制各了具有一對(duì)很好氧化還原峰和類似辣根過(guò)氧化物酶催化作用的苝四甲酸/卟啉鐵復(fù)合納米材料(PTC/hemin)。并結(jié)合葡萄糖氧化酶(GOx)作為封閉劑構(gòu)建了一種基于PTCA/hemin納米復(fù)合材料為氧化還原探針及催化劑的仿雙酶放大信號(hào)signal-on型電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。PTCA/hemin復(fù)合納米材料良好的成膜性避免了傳統(tǒng)固載電

9、活性物質(zhì)和酶的復(fù)雜過(guò)程，同時(shí)也減少了固載電活性物質(zhì)過(guò)程中電惰性物質(zhì)的加入，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。GOx作為封閉劑封閉傳感器表面的非特異性吸附位點(diǎn)，且同時(shí)構(gòu)建了仿雙酶催化放大響應(yīng)電流信號(hào)，進(jìn)而進(jìn)一步提高了電化學(xué)適體傳感器的靈敏度。
　　 第六章，雙酶催化放大信號(hào)優(yōu)于單酶催化體系，通過(guò)將hemin/G-quadruplex同時(shí)作為辣根過(guò)氧化物模擬酶和NADH氧化酶構(gòu)建了仿雙酶夾心式電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。與傳統(tǒng)的酶標(biāo)適體傳感