秸稈類生物質(zhì)暗發(fā)酵產(chǎn)氫關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化及其機(jī)理研究.pdf

1、氫能因其具有高效、清潔、無(wú)污染的特點(diǎn)被公認(rèn)為最具發(fā)展前景的能源之一。在諸多的制氫方法中，生物制氫因其能夠在常溫常壓下操作而備受關(guān)注。與光合制氫相比，暗發(fā)酵制氫具有產(chǎn)氫速率高、不依賴光照、設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作、能夠?qū)崿F(xiàn)廢棄生物質(zhì)資源化等特點(diǎn)而最具產(chǎn)業(yè)化前景。目前，該技術(shù)普遍存在產(chǎn)氫率低、發(fā)酵底物成本高等問(wèn)題，成為制約暗發(fā)酵制氫產(chǎn)業(yè)化的主要技術(shù)瓶頸?；诖耍疚脑谔綄ぬ烊痪搭A(yù)處理方法的基礎(chǔ)上，從高效生物制氫反應(yīng)器中分離、篩選得到一株底物利用范

2、圍廣的高效兼性厭氧菌，對(duì)其產(chǎn)氫特性進(jìn)行了研究，并從生化工程的角度對(duì)其中的NADH產(chǎn)氫途徑進(jìn)行調(diào)控;之后，從降低運(yùn)行成本的角度，篩選分離在中溫條件下能夠直接利用未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的秸稈類生物質(zhì)高效發(fā)酵產(chǎn)氫的微生物，進(jìn)行菌種鑒定及相關(guān)的產(chǎn)氫特性研究。
　　具體內(nèi)容如下:
　　1.探尋新的菌源預(yù)處理方式。
　　系統(tǒng)考察了微波輻射預(yù)處理對(duì)混合菌源產(chǎn)氫性能的綜合影響。結(jié)果顯示:采用微波輻射對(duì)牛糞堆肥進(jìn)行預(yù)處理，能夠有效抑制或殺滅嗜氫菌

3、，而保留產(chǎn)氫菌的活性。以20g/L酸解玉米秸稈為底物，利用微波輻射1.5min預(yù)處理的牛糞堆肥為菌源，在Na2CO3添加量800mg/L，F(xiàn)e添加量400mg/L時(shí)，產(chǎn)氫量最大，達(dá)到144.3ml/g。與其它菌源預(yù)處理方式相比，該方法操作安全簡(jiǎn)單，能耗低，耗時(shí)少，且菌源產(chǎn)氫能力更高。
　　通過(guò)AFM，蛋白濃度測(cè)定和PCR-DGGE技術(shù)研究了微波輻射作用機(jī)理在于:微波輻射能夠?qū)粗形⑸锛?xì)胞壁造成不同程度的損傷和破壞，進(jìn)而影響微生

4、物細(xì)胞的通透性;此外，微波還能對(duì)微生物的基因組DNA造成不同程度的損傷，由此導(dǎo)致對(duì)微波輻射敏感的嗜氫菌的失活或殺滅;而主要的產(chǎn)氫菌形成的芽孢具有極強(qiáng)的耐輻射和耐熱能力，短時(shí)的微波輻射不會(huì)對(duì)其造成損傷，產(chǎn)氫菌的活性得以保持。
　　2.從生物制氫反應(yīng)器中分離得到一株高效兼性厭氧產(chǎn)氫菌。首先對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性研究，結(jié)合菌株16SrDNA序列分析，確定該菌株的種屬分類。對(duì)菌株產(chǎn)氫特性進(jìn)行研究:菌株Bacillussp.FS2

5、011能利用多種碳、氮源產(chǎn)氫。以葡萄糖為底物時(shí)，最大產(chǎn)氫量為2.26mol/mol。發(fā)酵液的初始pH和培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)氫活性有影響，初始pH6.98、35℃為該菌種發(fā)酵產(chǎn)氫較為適宜的條件。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法及響應(yīng)面分析法對(duì)菌株Bacillussp.FS2011發(fā)酵產(chǎn)氫條件進(jìn)行優(yōu)化。首先采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出影響菌株產(chǎn)氫的主要因素:葡萄糖濃度、牛肉膏濃度和磷酸緩沖

6、液濃度。在此基礎(chǔ)上，利用最陡爬坡路徑大致確定最大響應(yīng)區(qū)域，最后利用Box-Behnke試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，三個(gè)主要因素的濃度變化顯著影響氫氣產(chǎn)量。通過(guò)求解回歸方程，確定最優(yōu)產(chǎn)氫條件:當(dāng)葡萄糖濃度13.52g/L，牛肉膏濃度1.95g/L，磷酸緩沖液濃度19.36mmol/L時(shí)，氫氣產(chǎn)量達(dá)到理論最大值3079.0ml/L，實(shí)際產(chǎn)氫量達(dá)到3081.2ml/L。
　　3.對(duì)Bacillussp.FS2011中NAD

7、H產(chǎn)氫途徑進(jìn)行強(qiáng)化。首先，在培養(yǎng)基中使用與葡萄糖結(jié)構(gòu)類似，氧化還原狀態(tài)不同的底物作為碳源進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗(yàn)，確定FS2011胞內(nèi)存在NADH產(chǎn)氫途徑。
　　采用丙酮酸脫氫酶系E1抑制劑對(duì)菌源產(chǎn)氫過(guò)程進(jìn)行干涉，以期能夠充分發(fā)揮NADH產(chǎn)氫途徑的作用。首先考察了抑制劑濃度對(duì)兼性厭氧純菌和混合菌源發(fā)酵產(chǎn)氫量的影響。之后，考察了特定濃度抑制劑的添加對(duì)兼性厭氧純菌和混合菌源產(chǎn)氫性能的綜合影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加適量的抑制劑能夠有效提高發(fā)酵體系的氫

8、氣產(chǎn)量，同時(shí)降低體系中乙酸和丁酸等副產(chǎn)物的生成，降低了后續(xù)發(fā)酵廢水的處理難度。
　　4.從利用生玉米秸稈?cǎi)Z化的生物制氫反應(yīng)器中分離得到一株能夠在中溫條件下，不經(jīng)過(guò)底物預(yù)處理，高效利用生玉米秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫的細(xì)菌。根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性，并結(jié)合菌株16SrDNA序列分析，確定菌株FS3的種屬分類。
　　菌株Clostridiumsp.FS3能利用多種碳源產(chǎn)氫。以生玉米秸稈和酸解秸稈為底物時(shí)，產(chǎn)氫量分別為73.1和75.3m

9、l/g-cornstalk，初步判斷該菌株能夠直接利用秸稈中的半纖維素產(chǎn)氫。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)Clostridiumsp.FS3發(fā)酵產(chǎn)氫培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，碳酸氫銨、磷酸二氫鉀和營(yíng)養(yǎng)液的濃度變化能夠顯著影響氫氣產(chǎn)量，通過(guò)求解回歸方程得到如下結(jié)論:當(dāng)生玉米秸稈濃度20g/L，碳酸氫銨濃度1.76g/L，磷酸二氫鉀濃度0.91g/L，營(yíng)養(yǎng)液的添加量為1