Geobacillus thermodenitrificans NG80-2烷烴單加氧酶LadA的分子生物學(xué)改造.pdf

1、石油作為人類的重要能源正在不斷減少。在開發(fā)和利用石油的過程中，環(huán)境也不可避免的遭到了破壞。研究新的采油技術(shù)和石油污染修復(fù)技術(shù)將會(huì)很好的解決上述問題。
　　 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2分離子天津大港油田。通過前期基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)NG80-2存在一條降解長鏈烷烴途徑，ladA是這條途徑中最重要的一個(gè)基因，它參與NG80-2降解長鏈烷烴的第一步反應(yīng)，能把直鏈飽和烷烴(C

2、15～C36)氧化為相應(yīng)的伯醇。LadA嗜熱，可溶，是單一組分酶，易于在E.coli中表達(dá)和純化。這些優(yōu)良性狀使得LadA在工業(yè)合成、石油開采和石油環(huán)境污染等領(lǐng)域有很大的潛力。
　　 本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過定點(diǎn)突變、融合蛋白等分子生物學(xué)方法改造了LadA酶分子，構(gòu)建了6個(gè)LadA突變克隆，5個(gè)LadA與輔酶依賴NADH的FMN還原酶克隆(區(qū)別在于ladA和其輔酶基因的鏈接臂密碼子不同)，對這11個(gè)克隆進(jìn)行了E.coli中表

3、達(dá)條件的優(yōu)化，最終純化出兩個(gè)LadA改造蛋白：F146C突變蛋白和一個(gè)LadA/依賴NADH的FMN還原酶融合蛋白，其他9個(gè)改造蛋白均以包涵體形式存在，需要進(jìn)一步對其進(jìn)行優(yōu)化。構(gòu)建了9個(gè)LadA突變酶在Pseudomonas fluorescens KOB2△1(一株缺失菌)的互補(bǔ)菌株。通過在C16中的培養(yǎng)9個(gè)互補(bǔ)菌株(LadA互補(bǔ)菌株為參考菌株；不加碳源C16培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株為負(fù)對照)和測定生長曲線，體內(nèi)驗(yàn)證了這9個(gè)LadA突變活性，