無花果ACC合成酶基因克隆及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、無花果（FicuscaricaL.）屬?？疲∕oraceae）榕屬（Ficus），果實(shí)味美，且具有抗癌防衰老等保健價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。但無花果采后迅速軟化，適宜條件下冷藏也僅可保證7～10d的貨架期，嚴(yán)重阻礙了無花果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
　　 培育抗軟化、耐貯運(yùn)無花果的品種具有重要的實(shí)際意義:傳統(tǒng)保鮮技術(shù)在生產(chǎn)中成本高、管理困難且收效甚微，所以培育耐貯運(yùn)的高品質(zhì)無花果品種，成為無花果育種的重要目標(biāo)之一。
　　 乙烯是導(dǎo)致躍變型果

2、實(shí)衰老軟化的關(guān)鍵因素，抑制果實(shí)成熟期間乙烯的生物合成，可有效延緩果實(shí)的衰老軟化過程。因此通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控乙烯生物合成過程中兩個(gè)關(guān)鍵酶——ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)，有望解決無花果的完熟軟化問題。
　　 本研究以無花果果實(shí)為研究對象，從綠果無花果“青皮”基因組DNA中分離了ACS1基因片段，構(gòu)建了ACS1基因的反義及RNAi植物表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，為采用生物技術(shù)方法延緩或抑制無花果軟化、提高其耐貯

3、性奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、青皮無花果ACS1基因片段的克隆。根據(jù)GenBank中登錄的MasuiDauphine無花果ACS1基因保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成了一對特異引物，PCR擴(kuò)增得到一條長590bp的特異片段，序列分析結(jié)果表明，除引物外，該序列與GenBank上已登陸的MasuiDauphine-ACS1的cDNA序列同源性達(dá)99％，氨基酸的同源性達(dá)98％，無內(nèi)含子序列。表明該克隆片段是青皮無花果ACS1基因片

4、段。
　　 2、無花果反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建。將克隆到的無花果ACS1基因片段反向插入到中間載體pBI221質(zhì)粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成反義中間表達(dá)載體pBI221-anti-ACS1。用XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切pBI221-anti-ACS1表達(dá)載體及pBI121質(zhì)粒，酶切下中間表達(dá)載體pBI221-anti-ACS1的反義片段、GusA基因和NOS終止子，定向插入到切除了GusA基因和NOS終止子的pBI

5、121質(zhì)粒中，構(gòu)建成反義植物表達(dá)載體pBI121-anti-ACS1。
　　 3、無花果RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建。先將無花果ACS1基因片段正向插入到反義中間表達(dá)載體pBI221-anti-ACS1質(zhì)粒的BamHⅠ-SmaⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成RNAi中間表達(dá)載體pBI221-RNAi-ACS1;再用XbaⅠ/EcoRⅠ雙酶切pBI221-RNAi-ACS1表達(dá)載體及pBI121質(zhì)粒，將從載體pBI221-anti-ACS1切