PCLA-PEG-PCLA溫致水凝膠的合成、多肽包裹與修飾及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、可注射性水凝膠材料在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。水凝膠的含水量和模量等基本性質(zhì)與人體的軟組織接近,而且它們注射使用的植入方式能與“微創(chuàng)”技術(shù)結(jié)合,有利于減輕病患痛苦和加快術(shù)后愈合。其中,由聚乙二醇和可降解聚酯組成的嵌段聚合物水凝膠材料,由于其可降解吸收性和溫致凝膠化的特點(diǎn)近年來受到研究者較多的關(guān)注;由于材料凝膠化過程不涉及化學(xué)反應(yīng),且其高分子嵌段的基本組成是FDA所批準(zhǔn)過的醫(yī)用材料,因此有望具備良好的生物相容性和安全性,使其更有希望獲

2、得臨床應(yīng)用。近年來有研究報(bào)道將聚乙二醇和聚酯所組成的嵌段聚合物溫致水凝膠作為藥物緩釋載體,但其作為組織修復(fù)材料的研究還相對(duì)很少。后者還需要考慮細(xì)胞在材料上的黏附、降解產(chǎn)物對(duì)創(chuàng)面愈合的影響等更為復(fù)雜的問題。
　　本博士論文針對(duì)聚醚一聚酯嵌段共聚物溫致物理水凝膠體系在可注射性組織工程材料方面的潛在應(yīng)用開展了高分子材料方面的基礎(chǔ)研究,在此過程中我們還嘗試了該材料在防止術(shù)后粘連方面的應(yīng)用。論文試圖將高分子科學(xué)、合成化學(xué)、生物醫(yī)用材料與臨床

3、醫(yī)學(xué)交叉融合,工作涉及了從材料制備到醫(yī)學(xué)應(yīng)用前期工作的多個(gè)方面。
　　論文以親水的聚乙二醇(PEG)和疏水的可降解聚酯(PCLA)所組成的三嵌段共聚物(PCLA-PEG-PCLA)作為主要的高分子研究對(duì)象,研究內(nèi)容包括聚合物和多肽的合成、水凝膠制備、溶膠一凝膠轉(zhuǎn)變性能的調(diào)控、凝膠材料的生物相容性和體內(nèi)外降解行為的評(píng)價(jià)、多肽生物活性分子的包裹與修飾、以及在預(yù)防術(shù)后腸粘連和作為可注射性組織工程材料這兩個(gè)方面的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用等部分。本論文

4、的主要?jiǎng)?chuàng)新性工作包括以下幾方面:
　　1.合成了降解產(chǎn)物酸性相對(duì)較低的、可物理凝膠化的無定形PCLA-PEG-PCLA嵌段共聚物。本論文通過開環(huán)聚合,合成了一系列中間為聚乙二醇、兩端為疏水聚酯的三嵌段聚合物。通過調(diào)整疏水聚酯鏈段的長度等,將聚合物水溶液的凝膠轉(zhuǎn)變溫度控制在室溫和體溫之間,使其呈現(xiàn)“室溫溶膠、體溫凝膠”的可注射凝膠特性,為未來臨床應(yīng)用帶來了便利。通過己內(nèi)酯(CL)與丙交酯(LA)的無規(guī)共聚,一方面降低了單純使用PLA

5、作為疏水嵌段而導(dǎo)致的使用過程中酸性降解產(chǎn)物的副作用,另一方面也避免了僅使用PCL作為疏水嵌段所引起的材料由結(jié)晶而導(dǎo)致的儲(chǔ)存過程中提前物理凝膠化的問題。
　　2.驗(yàn)證了所合成聚合物的體內(nèi)外生物相容性、并發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的物理水凝膠具有良好的凝膠保持特性和適宜的可降解性。為了研究材料基本的生物相容性和生物安全性能,我們按照國家標(biāo)準(zhǔn)“醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)”的相關(guān)要求設(shè)計(jì)了體外的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),證實(shí)材料對(duì)細(xì)胞黏附和增殖無顯著影響;通過相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證

6、實(shí)了材料在使用時(shí)不會(huì)引起明顯的溶血和熱原反應(yīng);同時(shí)對(duì)體內(nèi)植入部位的組織進(jìn)行切片染色和組織學(xué)分析,證實(shí)了材料在體內(nèi)良好的生物相容性,沒有出現(xiàn)可見的組織病變和嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。通過體外模擬生理?xiàng)l件,研究了材料的降解行為,發(fā)現(xiàn)凝膠在體外能維持近12周,分子量呈線性下降,不同于聚酯材料通常所見的自催化所導(dǎo)致的指數(shù)下降特性;將材料埋植于新西蘭兔皮下,發(fā)現(xiàn)材料在動(dòng)物體內(nèi)降解加快,可能是體內(nèi)的一些酶的參與加速了聚酯的降解,但是體內(nèi)存在時(shí)間仍然可達(dá)到6周

7、,比Pluronic等傳統(tǒng)的物理水凝膠的保持時(shí)間(通常1天左右)長一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。
　　3.首次嘗試PCLA-PEG-PCLA溫致物理水凝膠在術(shù)后防粘連方面的應(yīng)用,并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得成功。外科手術(shù)中的組織粘連是一個(gè)十分普遍的問題,防止術(shù)后粘連十分重要。由兩親性嵌段聚合物膠束自組裝而形成的該物理凝膠,其表面富集了大量的親水的PEG鏈段。PEG能有效抵抗蛋白和細(xì)胞的黏附,因此,我們推測,該聚合物有望作為一種防粘連材料,并且我們的溫敏凝

8、膠可以通過注射的方式植入體內(nèi),能與腹腔鏡、關(guān)節(jié)鏡等微創(chuàng)醫(yī)療手段相結(jié)合。通過合作研究,我們利用新西蘭兔的腹壁和盲腸損傷模型,將水凝膠注射植入創(chuàng)面,起到了隔離作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明:水凝膠在使用便利性和預(yù)防組織粘連上的效果上都明顯優(yōu)于市售的PLA膜材料,并且凝膠良好的生物相容性不會(huì)影響術(shù)后創(chuàng)面的愈合。這樣,我們首次將該嵌段共聚物物理凝膠嘗試用于防止術(shù)后粘連,并且在方便操作的同時(shí),起到了良好的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果。
　　4.發(fā)現(xiàn)在水凝膠中包裹促

9、進(jìn)細(xì)胞黏附的多肽不僅不會(huì)妨礙術(shù)后粘連,還會(huì)顯著增強(qiáng)術(shù)后防粘連的效果。本文還利用了水凝膠對(duì)小分子的緩釋特性,將具有與細(xì)胞特異性相互作用的多肽cyclo(-RGDfK-)包裹其中,發(fā)現(xiàn)可實(shí)現(xiàn)一周左右的持續(xù)釋放;而在術(shù)后粘連發(fā)生的過程中,炎癥細(xì)胞的遷移和黏附是粘連組織形成的重要步驟,其發(fā)生的時(shí)間一般集中在術(shù)后一周內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),我們的水凝膠緩釋多肽分子能進(jìn)一步抑制術(shù)后組織粘連的發(fā)生;水凝膠釋放RGD多肽的實(shí)驗(yàn)組與單純使用凝膠或多肽相比,

10、在預(yù)防粘連上的效果更好。RGD多肽固定于材料表面能夠促進(jìn)細(xì)胞向材料黏附,但未固定的RGD分子能在釋放以后與材料外部的細(xì)胞上的整合素結(jié)合,占據(jù)細(xì)胞上整合素結(jié)合位點(diǎn),反而抑制了這些細(xì)胞向材料的黏附。
　　5.首次對(duì)于PCLA-PEG-PCLA的不同嵌段平行進(jìn)行多肽修飾、并發(fā)現(xiàn)嵌段共聚物的多肽修飾具有顯著的位置效應(yīng)。上述水凝膠的另外一個(gè)潛在應(yīng)用方向?yàn)榻M織工程材料,這類溫致物理凝膠化的現(xiàn)象提供了極好的可注射性材料的特性?？墒亲鳛橐环N組織工

11、程材料,細(xì)胞黏附性不佳是其瓶頸;與防粘連材料中包裹游離多肽不同,這里需要將多肽共價(jià)連接到嵌段聚合物中,就涉及到如何連接以及到底向那個(gè)嵌段連接更好的問題。為此我們通過Fmoc保護(hù)法固相合成一種能與細(xì)胞膜上的整合素發(fā)生特異結(jié)合的活性多肽分子cyclo(-RGDfK-),并且為了進(jìn)一步將多肽化學(xué)固定在水凝膠上,我們又合成了一種非對(duì)稱的光敏偶聯(lián)分子,其一端的疊氮基團(tuán)能通過紫外光引發(fā)與聚合物中的PEG發(fā)生插入反應(yīng),另一端羧基經(jīng)NHS活化后,能與多

12、肽的氨基發(fā)生偶合反應(yīng)。在建立上述合成基礎(chǔ)平臺(tái)的基礎(chǔ)上,本博士論文在國際上首次平行地將多肽分子化學(xué)連接到兩親性聚合物的親水嵌段和疏水嵌段。我們還進(jìn)一步比較了兩種不同連接方式所制備的聚合物材料與細(xì)胞相互作用時(shí)的效果差異。研究證明,對(duì)于兩親性嵌段聚合物而言,生物活性分子固定在親水鏈段能更好地起到促進(jìn)細(xì)胞黏附的作用。上述工作在提供了醫(yī)用高分子的修飾技術(shù)的同時(shí),也部分揭示了醫(yī)用高分子修飾的設(shè)計(jì)原理。
　　除了可注射性材料以外,博士論文期間還