多個豬lgGIIB類Fc受體剪接異體構(gòu)體的分子生物學(xué)特征.pdf

1、FcγRⅡ B是目前發(fā)現(xiàn)唯一的抑制型FcγR,在天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的負向調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。本研究克隆并鑒定了多個豬的FcγRⅡB轉(zhuǎn)錄體,對進一步深入研究FcγRⅡB的生物學(xué)特性及其介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用機制具有重要意義。
　　 本研究應(yīng)用RT-PCR方法,從豬肺巨噬細胞中共克隆出6個FcγRⅡB轉(zhuǎn)錄體,其ORF長度分別為951,891,894,948,639,519bp。經(jīng)序列與結(jié)構(gòu)分析,轉(zhuǎn)錄體1基因序列共編碼316個氨基

2、酸,包括45個氨基酸的N-端信號肽序列,179個氨基酸的胞外區(qū)序列(包含兩個Ig結(jié)構(gòu)域EC1,EC2),23個氨基酸組成的疏水跨膜區(qū)序列和69個氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)。以轉(zhuǎn)錄體1氨基酸序列為基礎(chǔ)分析其他5個轉(zhuǎn)錄體的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄體2 N-端有一個個丙氨酸的缺失,其信號肽僅由42個氨基酸組成,胞內(nèi)區(qū)缺失19個氨基酸；轉(zhuǎn)錄體3胞內(nèi)區(qū)缺失19個氨基酸；轉(zhuǎn)錄體4 N-端缺失一個丙氨酸,信號肽包含42個氨基酸,胞內(nèi)區(qū)缺失19個氨基酸；轉(zhuǎn)錄體5缺

3、失胞外區(qū)的EC2結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)區(qū)的19個氨基酸；轉(zhuǎn)錄體6缺失胞外區(qū)的EC2結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)及胞質(zhì)尾區(qū)的27個氨基酸,推測是一種推導(dǎo)性的可溶性Fc受體。6個轉(zhuǎn)錄體體中,轉(zhuǎn)錄體1和轉(zhuǎn)錄體3與以前鑒定的FcγRⅡB(FJ608551、DQ026064)ORF大小一致,轉(zhuǎn)錄體2,轉(zhuǎn)錄體4,轉(zhuǎn)錄體5和轉(zhuǎn)錄體6是4個新發(fā)現(xiàn)的豬FcγRⅡB,并且轉(zhuǎn)錄體5和轉(zhuǎn)錄體6是兩個新型FcγRⅡB,目前在人和其他動物中尚未發(fā)現(xiàn)與其有相似結(jié)構(gòu)的FcγRⅡB。6個轉(zhuǎn)錄體

4、與DQ026064相比,核酸同源性分別為98.8％,99.1％,99.6％,98.2％,98.7％,98.3％,氨基酸同源性分別為97.0％,97.6％,98.3％,96.3％,96.7％,95.4％。分析FcγRⅡB基因組序列,發(fā)現(xiàn)6個轉(zhuǎn)錄體均因mRNA的選擇性剪接而產(chǎn)生,同屬于FcγRⅡB的選擇性剪接異構(gòu)體,將其分別命名為FcγRⅡb1、FcγRⅡb2、FcγRⅡb3、FcγRⅡb4、FcγRⅡb5和FcγRⅡb6。
　　

5、將編碼FcγRⅡ b1-6 ORF基因片段分別亞克隆到真核表達載體pcDNA3.0中構(gòu)建真核表達質(zhì)粒,脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞,以鼠抗豬FcγRⅡB陽性血清和陰性血清分別處理轉(zhuǎn)染細胞。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測,陽性血清處理組FcγRⅡb1-6,pcDNA3.0空載體轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染COS-7細胞株分別為:25.3％、17.7％、20.0％、18.3％、14.4％、2.3％、2.5％、3.0％；陰性血清處理組FcγRⅡ b1-6,pcDNA3.0

6、空載體轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染COS-7細胞株分別為:2.7％、2.0％、2.2％、1.3％、1.5％、1.5％、1.3％、1.8％。結(jié)果顯示FcγRⅡb1-5轉(zhuǎn)染細胞株達10％以上的細胞表面可檢測到受體蛋白的表達,FcγRⅡ b6、空載體轉(zhuǎn)染細胞株和未轉(zhuǎn)染COS-7細胞表面未檢測到受體蛋白的表達。表明FcγRⅡb1-5在轉(zhuǎn)染細胞表面得到了表達。
　　 FcγRⅡb1-6真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細胞24h后,以400μg/ml G418選

7、擇性培養(yǎng)15天,轉(zhuǎn)染細胞株經(jīng)間接免疫熒光檢測,FcγRⅡb1-5約80％的轉(zhuǎn)染細胞可見熒光,FcγRⅡ b6、空載體轉(zhuǎn)染細胞株和未轉(zhuǎn)染COS-7細胞未見熒光,表明初步建立了穩(wěn)定表達FcγRⅡ b1-5受體蛋白的COS-7細胞系。
　　 以玫瑰花環(huán)試驗檢測豬FcγRⅡ B各剪接異構(gòu)體結(jié)合免疫復(fù)合物的生物學(xué)活性,結(jié)果顯示FcγRⅡb1-4轉(zhuǎn)染細胞周圍可形成明顯的玫瑰花環(huán),FcγRⅡb5、FcγRⅡb6、pcDNA3.0及未轉(zhuǎn)染細胞株

8、細胞周圍未出現(xiàn)玫瑰花環(huán),表明豬FcγRⅡb1—4具有結(jié)合IgG免疫復(fù)合物的生物學(xué)活性。
　　 以5倍稀釋鼠抗豬FcγRⅡB胞外區(qū)血清封閉豬PAM細胞,以不同濃度的非感染性Ig6免疫復(fù)合物處理LPS刺激的PAM細胞。應(yīng)用相對熒光定量方法檢測不同時間段(6,12,18,24h)內(nèi)IL-10、IFN-α和GM-CSF細胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示FcγRⅡ B封閉組IL-10、IFN-α和GM-CSF細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平較不封閉組