新型電化學(xué)生物傳感技術(shù)的研究及納米材料在其中的應(yīng)用.pdf

1、電化學(xué)生物傳感技術(shù)由于所需儀器簡單、選擇性好、分析速度快、檢測成本低、易于實現(xiàn)微型化等優(yōu)點,在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。如何利用電化學(xué)生物傳感技術(shù)快速、靈敏檢測疾病標(biāo)志物以及環(huán)境中重金屬離子,是當(dāng)前醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)中既新穎又極具吸引力的熱門研究課題之一。但是傳統(tǒng)電化學(xué)生物傳感器存在靈敏度較低,響應(yīng)速度慢以及穩(wěn)定性較差等缺點。近年來,納米材料的出現(xiàn)為解決這些問題提供了新的思路。將納米材料應(yīng)用到電化學(xué)生物傳感器中

2、,由于其獨特的性質(zhì)可提高傳感器的響應(yīng)性能,已成為當(dāng)前研究的焦點。此外,針對當(dāng)前有機小分子和其結(jié)合蛋白相互作用檢測中存在的問題,將這種特異性的相互作用轉(zhuǎn)換成對小分子標(biāo)記的DNA檢測,由于DNA檢測方法的多樣性,因此這種分析方法有望用于臨床藥物篩選和靶蛋白質(zhì)的靈敏檢測。本論文針對這些問題,發(fā)展了一系列成本低、操作簡單、靈敏度高的新型電化學(xué)生物傳感技術(shù),實現(xiàn)了對目標(biāo)物的高靈敏檢測。其主要內(nèi)容如下:
　　 (1)碳納米管(CNTs)由于

3、具有比表面積大、導(dǎo)電性強、電催化活性高等優(yōu)點,因而在電化學(xué)生物傳感技術(shù)領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。為了進一步拓寬CNTs在電化學(xué)生物分析中的應(yīng)用范圍,在第2章發(fā)展了一種新型的、基于磷脂修飾MWNTs(PL/MWNTs)作為電化學(xué)標(biāo)記物的電化學(xué)免疫傳感技術(shù)。在該方法中,首先,通過非共價作用在MWNTs表面修飾磷脂分子,再利用磷脂分子末端的氨基共價交聯(lián)單克隆抗體,這樣便得到了PL/MWNTs電化學(xué)標(biāo)記物。再通過傳統(tǒng)的磁分離免疫夾心反應(yīng)富集收集這

4、種標(biāo)記物,當(dāng)沉積到十八烷基硫醇絕緣膜修飾的電極表面后,由于碳納米管的隧道效應(yīng)改變了絕緣膜的性質(zhì),產(chǎn)生了電化學(xué)響應(yīng)信號。實驗結(jié)果表明,這種新型的電化學(xué)免疫傳感技術(shù)實現(xiàn)了對腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)的高靈敏、高特異性檢測,響應(yīng)動態(tài)范圍為5 pg/mL到100ng/mL,檢測限為3 pg/mL,而且還能對人血清樣品中PSA進行檢測。該方法靈敏度高、選擇性好、成本低,并可用于實際樣品的檢測。
　　 (2)鑒于上述發(fā)展的新型電化

5、學(xué)免疫傳感技術(shù)的高靈敏性和高特異性,為了拓寬這種技術(shù)在DNA分析中的應(yīng)用范圍,在第3章建立了一種基于單鏈DNA修飾MWNTS(ssDNA/MWNTs)作為電化學(xué)標(biāo)記物磁分離檢測DNA的電化學(xué)傳感技術(shù)。在這種分析方法中,通過非共價作用可將ssDNA修飾到MWNTs表面,這不僅能使MWNTs穩(wěn)定地分散水溶液中,同時又能使修飾在MWNTs表面DNA與目標(biāo)DNA發(fā)生雜交反應(yīng)。另外為了提高堿基錯配識別的能力,在磁性納米顆粒表面修飾了發(fā)夾探針。當(dāng)目

6、標(biāo)DNA存在時,磁珠表面的發(fā)夾探針構(gòu)象發(fā)生變化,莖部雙鏈結(jié)構(gòu)變?yōu)槿嵝詥捂溄Y(jié)構(gòu),再通過傳統(tǒng)的磁分離DNA夾心反應(yīng)可以選擇性收集ssDNA/MWNTs標(biāo)記物,當(dāng)吸附到十八烷基硫醇絕緣膜修飾的電極表面后,產(chǎn)生了二茂鐵的氧化還原峰電流。該方法對目標(biāo)DNA濃度檢測的動態(tài)線性范圍為1pM～500 nM,檢測限可達0.9 pM。另外還可利用此方法對乙肝病毒特異性序列突變情況進行檢測,使得突變型和野生型得到了很好的區(qū)分。
　　 (3)鑒于上述兩

7、個實驗方案中,磁分離盡管可以富集收集電化學(xué)標(biāo)記物MWNTs,但是磁性納米顆粒也會增加背景電流,同時為了進一步簡化上述實驗操作步驟,因此在第4章中又發(fā)展了一種基于MWNTs作為電化學(xué)標(biāo)記物通過鏈置換反應(yīng)檢測特定DNA序列的電化學(xué)生物傳感技術(shù)。在這種分析方法中,由于雙鏈互補DNA雜交反應(yīng)的結(jié)合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA與MWNTs作用力,因此當(dāng)有目標(biāo)DNA存在時會,修飾在MWNTs表面的ssDNA會從MWNTS表面解離出來,MWNTs繼而沉積到巰基十

8、六酸修飾的電極表面,產(chǎn)生了電化學(xué)響應(yīng)信號。而當(dāng)沒有目標(biāo)DNA鏈存在時,由于修飾在MWNTs表面的DNA在中性溶液中會與修飾在電極表面的巰基十六酸產(chǎn)生靜電排斥作用,致使MWNTs不能吸附在電極表面,降低了背景,因而實現(xiàn)了對目標(biāo)DNA的靈敏、快速檢測,其線性范圍在10 pM～100 nM之間,檢測下限為5 pM。
　　 (4)在第5章中,將MWNTs電化學(xué)標(biāo)記物鏈置換反應(yīng)和Hg2+能特異性識別特定堿基對T-T結(jié)合起來,實現(xiàn)了污水中H

9、g2+的檢測。實驗考察了鹽離子濃度、置換反應(yīng)的溫度以及干擾離子對此分析方法性能的影響。實驗結(jié)果表明,此傳感技術(shù)的電流響應(yīng)與Hg2+濃度在20 nM～10μM范圍成良好的準(zhǔn)線性關(guān)系,檢測下限10 nM。
　　 (5)有序三維結(jié)構(gòu)的納米材料不僅為酶的固定提供了大量的活性位點和良好的微生物環(huán)境,同時它還能保證酶與底物之間盡可能有較大的接觸面積,從而提高它在生物傳感器應(yīng)用中的響應(yīng)性能。在第6章中,將聚碳酸酯膜固定到玻碳電極表面,通過恒電

10、位沉積法制備了釕紫納米線陣列。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),釕紫納米線陣列修飾的玻碳電極在低電位下對過氧化氫有良好的響應(yīng)性能。另外當(dāng)把葡萄糖氧化酶固定到釕紫納米線陣列的表面后,葡萄糖氧化酶依然能保持良好的生物活性,因此通過此方法得到了性能良好的葡萄糖傳感器。
　　 (6)層狀材料由于具有層間距可調(diào)的性質(zhì),因此可往其層間插入各種各樣不同尺寸大小的化合物。再加上這類無機化合物具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性、比表面積大、表面電荷密度高等優(yōu)點,可適用

11、于蛋白質(zhì)的固定。在第7章中,提出了一種基于α-磷酸鋯層狀材料負(fù)載葡萄糖氧化酶的電化學(xué)生物傳感器,并將其應(yīng)用到葡萄糖的檢測中。首先利用直接沉淀法制備了α-磷酸鋯層狀材料,在中性條件下將葡萄糖氧化酶插入到α-磷酸鋯層狀材料中,再通過殼聚糖分散并固定到電極表面。由于α-磷酸鋯層狀材料具有開放的結(jié)構(gòu),可使得葡萄糖氧化酶與底物充分地接觸,從而提高了酶催化反應(yīng)的效率。實驗結(jié)果表明,該方法可實現(xiàn)了對葡萄糖的快速、靈敏定量檢測,其線性范圍為0.01 m

12、M～20 mM,檢測下限為0.01mM。
　　 (7)利用小分子標(biāo)記的DNA來檢測有機小分子與其結(jié)合蛋白質(zhì)的相互作用是當(dāng)前藥物篩選和靶蛋白檢測的一種新方法,其原理在于把這種特異性地相互作用轉(zhuǎn)換成對DNA的分析,同時由于DNA放大檢測方法的多樣性,因此使得這種分析方法有望成為研究有機小分子和蛋白質(zhì)相互作用的信號傳導(dǎo)平臺。核酸外切酶Ⅰ末端保護分析就是這種分析方法中的一種,即當(dāng)有機小分子與其結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合后抑制了ExoI對其降解,保存