托盤(pán)和真空包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中菌相變化規(guī)律研究.pdf

1、冷卻肉處于低溫環(huán)境中,許多細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制,但肉中污染的一些嗜冷菌,在冷藏條件下仍然會(huì)大量生長(zhǎng)和繁殖,最終導(dǎo)致冷卻肉發(fā)生腐敗變質(zhì)。關(guān)于冷卻肉污染微生物及貯藏過(guò)程中微生物的動(dòng)態(tài)變化已有很多研究報(bào)道,但大多是基于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)手段,而許多基于傳統(tǒng)方法的研究并不能全面反映冷卻肉中微生物動(dòng)態(tài)變化的真實(shí)情況。近年來(lái),基于16S rRNA基因分子技術(shù)正被越來(lái)越多地應(yīng)用于食品微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。本研究的目的是運(yùn)用變性梯度凝膠電泳(Denaturi

2、ng gradient gelelectrophoresis,DGGE)、末端限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(Terminal restriction fragment length
　　 polymorphism,TRFLP),分析托盤(pán)包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中菌相變化,運(yùn)用DGGE及傳統(tǒng)乳酸菌分離純化技術(shù),分析真空包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中菌相變化,確定冷卻豬肉兩種包裝方式下主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌,進(jìn)一步運(yùn)用Real-time PCR方法對(duì)主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌

3、進(jìn)行定量分析,進(jìn)而揭示其貯藏過(guò)程中菌相變化規(guī)律,為控制肉品污染,提高產(chǎn)品質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.冷卻豬肉不同前處理對(duì)細(xì)菌DNA提取及PCR-DGGE的影響
　　 運(yùn)用分子生物學(xué)方法研究微生物的第一步驟就是樣品DNA提取。前處理方法不同可能會(huì)影響DNA提取效果并進(jìn)而影響后續(xù)的PCR等實(shí)驗(yàn)結(jié)果,故本實(shí)驗(yàn)比較研究冷卻豬肉不同前處理對(duì)細(xì)菌DNA提取及PCR-DGGE的影響。冷卻豬肉4℃貯藏至第5

4、天時(shí),分別采用凍融、超聲,搖床和勻漿前處理后,提取肉中細(xì)菌 DNA,進(jìn)行Dilution-PCR和DGGE分析。結(jié)果表明,不同前處理方法所制備的DNA量稍有差別,而細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)和V6-V8區(qū)PCR-DGGE結(jié)果無(wú)顯著差異,所以可根據(jù)實(shí)際情況選擇上述不同前處理方法,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件和本實(shí)驗(yàn)具體要求,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品前處理采用搖床法。同時(shí)對(duì)16S rDNAV3區(qū)的DGGE圖譜進(jìn)行割膠測(cè)序,檢測(cè)到腐敗菌主要是假單胞菌屬,

5、其他還有不動(dòng)桿菌屬、環(huán)絲菌屬和沙雷氏菌屬。
　　 2.托盤(pán)包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中菌相變化研究
　　 運(yùn)用PCR-DGGE、TRFLP技術(shù),研究托盤(pán)包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中的菌相變化,確定主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌,進(jìn)一步運(yùn)用 Real—time PCR中的△△CT方法對(duì)該菌進(jìn)行定量研究。結(jié)果如下:
　　 選擇性培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果表明,貯藏過(guò)程中假單胞菌增長(zhǎng)最為迅速,熱死環(huán)絲菌和假單胞菌成為冷卻豬肉貯藏末期主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。直接提取冷卻

6、豬肉細(xì)菌 DNA,其Dilution-PCR結(jié)果表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),冷卻肉中細(xì)菌量逐漸增多,這種半定量方法結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果趨勢(shì)一致。可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA基因V3區(qū)和V6-V8區(qū)DGGE結(jié)果表明,冷卻豬肉中可培養(yǎng)細(xì)菌的組成在不同貯藏時(shí)期是不同的。可培養(yǎng)細(xì)菌與不經(jīng)培養(yǎng)直接提取冷卻豬肉細(xì)菌 DNA同時(shí)進(jìn)行PCR-DGGE,16S rRNA基因V3區(qū)和V6-V8區(qū)DGGE圖譜存在差異。
　　 直接提取冷卻豬肉細(xì)菌 DN

7、A,分別對(duì)16S rRNA基因V3和V6-V8可變區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE分析,結(jié)合克隆測(cè)序,結(jié)果表明肉中初始菌相較復(fù)雜,貯藏末期主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌,但V3可變區(qū)發(fā)現(xiàn)還有熱死環(huán)絲菌,不同可變區(qū)結(jié)果不完全一致。本實(shí)驗(yàn)所得的假單胞菌克隆,基于不同可變區(qū)的DGGE分析,亦發(fā)現(xiàn)基于不同可變區(qū)進(jìn)行DGGE研究時(shí)結(jié)果存在差異。
　　 直接提取冷卻豬肉細(xì)菌DNA,進(jìn)行PCR-TRFLP分析,同時(shí)結(jié)合16S rRNA基因克隆文庫(kù)和測(cè)序方法,

8、得到的TRFLP圖譜中共產(chǎn)生35種譜帶,表明冷卻肉中微生物組成十分復(fù)雜,對(duì)應(yīng)于假單胞菌的譜帶峰貯藏過(guò)程中變化明顯,其相對(duì)峰面積由0 d的5.7％至貯藏末期達(dá)到83.4％,表明主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌。
　　 運(yùn)用Real-time PCR相對(duì)定量方法分析托盤(pán)包裝肉樣中假單胞菌。肉樣中假單胞菌與總細(xì)菌兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值為0.004,小于0.1,表明兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率已非常接近,可用△△CT法對(duì)假單胞菌進(jìn)行相對(duì)定量分析?！鳌鰿T

9、法相對(duì)定量表明貯藏過(guò)程中肉樣中假單胞菌增長(zhǎng)迅速,從0 d的小于0.001至貯藏末期達(dá)到4.438,在總細(xì)菌中所占比例迅速增高。
　　 綜上所述,運(yùn)用PCR-DGGE、TRFLP技術(shù),研究托盤(pán)包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中的菌相變化,確定主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌,進(jìn)一步運(yùn)用Real-time PCR中的△△CT相對(duì)定量方法發(fā)現(xiàn)該菌增長(zhǎng)迅速。三種方法證實(shí)了托盤(pán)包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中假單胞菌為主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。
　　 3.真空包裝冷卻豬

10、肉冷藏過(guò)程中菌相變化研究
　　 真空包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中,分離純化乳酸菌,運(yùn)用PCR-DGGE研究貯藏過(guò)程中乳酸菌的變化,同時(shí)不經(jīng)培養(yǎng)直接提取肉中細(xì)菌 DNA,運(yùn)用PCR-DGGE及Lactobcillus group-specific PCR-DGGE方法,研究其貯藏過(guò)程中的菌相變化,確定主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌.進(jìn)一步運(yùn)用Real-time PCR中的△△CT方法對(duì)該菌進(jìn)行定量研究。結(jié)果如下:
　　 選擇性培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果表明,

11、真空包裝條件下乳酸菌生長(zhǎng)迅速,而其他細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制,4℃貯藏時(shí)冷卻豬肉貨架期接近14 d。MRSA分離純化的乳酸菌,運(yùn)用PCR-DGGE結(jié)合16Sr RNA基因序列分析,真空包裝冷卻豬肉中共獲得8種乳酸菌。不同貯藏時(shí)間乳酸菌組成不同,清酒乳桿菌成為貯藏末期最主要的乳酸菌,占71.4％。
　　 直接提取冷卻肉細(xì)菌DNA,對(duì)16S rRNA基因V3區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE分析,結(jié)合割膠測(cè)序,結(jié)果表明貯藏末期乳酸菌(肉食桿菌、清酒乳桿

12、菌、乳球菌)成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。運(yùn)用Lactobacillus group-specific PCR-DGGE研究發(fā)現(xiàn),真空包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中乳桿菌樣細(xì)菌逐漸增多,貯藏末期清酒乳桿菌最多。
　　 運(yùn)用Real-time PCR相對(duì)定量方法分析真空包裝肉樣中乳酸桿菌。肉樣中乳酸桿菌與總細(xì)菌兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值為0.096,小于0.1,表明兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率已非常接近,可用△△CT法對(duì)乳酸桿菌進(jìn)行相對(duì)定量分析。△△CT法相對(duì)定量表