Development of Fluorescence Quantitative PCR method for Detection Dibutyl Phthalate.pdf

1、本課題研究目的旨在建立采用熒光定量PCR檢測(cè)鄰苯二甲酸二丁酯濃度的新方法。鄰苯二甲酸二丁酯可以活化雌激素受體使之與包含特定序列的雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合的DNA因受到保護(hù)可抵抗核酸外切酶ExoⅢ的消解而被保留，痕量的保留DNA可通過(guò)PCR擴(kuò)增定量。根據(jù)該原理，首先從鯉魚(yú)肝臟細(xì)胞中提取含雌激素受體的細(xì)胞溶質(zhì)，再與不同濃度的鄰苯二甲酸二丁酯結(jié)合使雌激素受體活化，形成配體-受體復(fù)合物。然后，以雙鏈pUC19質(zhì)粒DNA作為模板，設(shè)計(jì)合成特異性引物序

2、列，通過(guò)普通PCR擴(kuò)增制備雙鏈結(jié)合DNA，使雙鏈結(jié)合DNA與配體-受體復(fù)合物反應(yīng)結(jié)合后，用核酸外切酶ExoⅢ和S1核酸酶消解，去除未受到保護(hù)的DNA。利用消解后產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而建立Ct值與鄰苯二甲酸二丁酯濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)探索最優(yōu)反應(yīng)條件，并確定熒光定量PCR的最低檢測(cè)限及其結(jié)果的重復(fù)性。將該方法用于檢測(cè)實(shí)際環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的含量，并將檢測(cè)結(jié)果同高效液相色譜法進(jìn)行比較，比較兩種檢測(cè)方法的不同。<

3、br>　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鄰苯二甲酸二丁酯濃度在10-5g/L至10-10g/L之間時(shí)，鄰苯二甲酸二丁酯濃度與Ct值線性關(guān)系顯著。當(dāng)鄰苯二甲酸二丁酯濃度為10-10g/L時(shí)，結(jié)果呈正相關(guān)性。在該方法中，鄰苯二甲酸二丁酯的檢測(cè)下限是8.439pg/L。將熒光定量PCR技術(shù)用于檢測(cè)水和土壤樣品中的鄰苯二甲酸二丁酯濃度，其檢測(cè)結(jié)果分別為0.1058μg/L和0.1357ug/g。
　　 同時(shí)在高效液相色譜法與熒光定量PCR方法檢測(cè)鄰