纖維素基復(fù)合層析基質(zhì)的功能化與應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、層析技術(shù)由于其分離機(jī)制多樣性和操作的相對(duì)簡便性，成為新型分離方法和集成化技術(shù)研究的焦點(diǎn)。擴(kuò)張床吸附層析和疏水性電荷誘導(dǎo)層析是新型層析分離和集成化技術(shù)的典型代表。 在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，本文以纖維素基復(fù)合層析介質(zhì)的設(shè)計(jì)、制備和應(yīng)用為主線，側(cè)重于基質(zhì)的功能化，開展了四個(gè)方面的工作：其一，纖維素球形基質(zhì)的物理性能改進(jìn)，采用合適的手段，實(shí)現(xiàn)基質(zhì)的孔道擴(kuò)增和密度增大；其二，基質(zhì)的化學(xué)改性，對(duì)纖維素基質(zhì)進(jìn)行活化處理，實(shí)現(xiàn)功能配基的有效偶

2、聯(lián)；其三，制備功能化的層析介質(zhì)，包括弱陰離子交換擴(kuò)張床介質(zhì)和疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，進(jìn)行介質(zhì)的性能評(píng)價(jià)，研究介質(zhì)與目標(biāo)蛋白的相互作用；其四，應(yīng)用研究，將功能化介質(zhì)應(yīng)用于實(shí)際的分離過程，包括固定床層析和擴(kuò)張床吸附。取得的主要結(jié)果如下： 纖維素基復(fù)合層析基質(zhì)的物理功能化：以再生纖維素為骨架，碳化鎢粉末為增重劑，糊化木薯淀粉為制孔劑，采用“反相懸浮熱再生法”和成球后去除淀粉方法，成功制備了纖維素/碳化鎢復(fù)合微球，可用作層析介質(zhì)的基質(zhì)。

3、基質(zhì)的物理特點(diǎn)在于大孔徑和高密度，實(shí)現(xiàn)了孔徑的可控?cái)U(kuò)增和密度的可控調(diào)節(jié)?；|(zhì)具有良好的球形外觀和對(duì)數(shù)正態(tài)粒徑分布，平均孔徑達(dá)到129nm，濕真密度與碳化鎢添加量呈線性相關(guān)，可達(dá)2.4mg/ml，孔結(jié)構(gòu)受增重劑的影響較小。復(fù)合層析基質(zhì)的柱層析行為表明：大孔型基質(zhì)的洗脫峰形明顯改善，柱壓小，適合于高流速的固定床和擴(kuò)張床層析；擴(kuò)張床內(nèi)可形成穩(wěn)定的分級(jí)分布，符合擴(kuò)張床吸附要求；可根據(jù)具體需要，調(diào)節(jié)碳化鎢添加比例來優(yōu)化操作流速和床層擴(kuò)張率。

4、 纖維素基復(fù)合層析基質(zhì)的化學(xué)功能化——陰離子交換配基：采用堿化和偶聯(lián)兩步反應(yīng)，將纖維素/碳化鎢復(fù)合層析基質(zhì)進(jìn)行陰離子交換的配基功能化，制備成大孔型、高密度的弱陰離子交換擴(kuò)張床吸附劑(Cell-TuC-DEAE)，考察了牛血清白蛋白(BSA)的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附性能。結(jié)果表明，靜態(tài)吸附容量達(dá)到97.1mg/ml；流速為500cm/h時(shí)(擴(kuò)張床內(nèi)擴(kuò)張率約為2)動(dòng)態(tài)吸附容量為66.6mg/ml；當(dāng)流速高達(dá)900cm/h時(shí)，動(dòng)態(tài)吸附容量仍有54.

5、5mg/ml。吸附動(dòng)力學(xué)研究表明，由于介質(zhì)具有大孔結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)擴(kuò)散傳遞迅速，與溶液中自由擴(kuò)散基本處在同一個(gè)數(shù)量級(jí)，驗(yàn)證了基質(zhì)擴(kuò)孔的必要性，適用于高流速的擴(kuò)張床吸附分離。 纖維素基復(fù)合層析基質(zhì)的化學(xué)功能化——疏水性電荷誘導(dǎo)配基：采用烯丙基溴(AB)和二乙烯基砜(DVS)活化，偶聯(lián)4-巰乙基吡啶(MEP)、2-巰基-1-甲基咪唑(MMI)和2-巰基苯并咪唑(MBI)，將纖維素/碳化鎢復(fù)合層析基質(zhì)進(jìn)行疏水性電荷誘導(dǎo)配基功能化，制備得到

6、四種大孔徑、高密度的疏水性電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)介質(zhì)Cell-TuC-AB-MEP，Cell-TuC-DVS-MEP，Cell-TuC-DVS-MMI和Cell-TuC-DVS-MBI?？疾炝朔磻?yīng)條件對(duì)活化和偶聯(lián)過程的影響，優(yōu)化了反應(yīng)條件。烯丙基溴活化密度可達(dá)137μmol/ml，偶聯(lián)后MEP配基密度為90μmol/ml；二乙烯基砜活化密度達(dá)到93μmol/ml，配基偶聯(lián)密度約60μmol/ml。 疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)與蛋白

7、質(zhì)的相互作用：考察了HCIC介質(zhì)與模型蛋白質(zhì)(卵黃免疫球蛋白IgY和BSA)的相互作用，從吸附平衡、吸附動(dòng)力學(xué)、層析柱保留因子和穿透曲線等方面探討了HCIC介質(zhì)的吸附機(jī)理和性能特點(diǎn)。結(jié)果表明，溶液pH和鹽濃度是影響吸附的關(guān)鍵因素。在pH=5左右，即蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，吸附作用達(dá)到最大，IgY靜態(tài)吸附量達(dá)到100mg/ml以上；pH升高，吸附容量呈下降趨勢；pH下降到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和介質(zhì)配基的pKα值以下，產(chǎn)生靜電排斥作用，實(shí)現(xiàn)解吸。添加鹽可

8、以適度增加介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。四種介質(zhì)中吸附量Cell-TuC-DVS-MBI最大，而吸附選擇性Cell-TuC-DVS-MMI和Cell-TuC-AB-MEP較好。Cell-TuC-AB-MEP的洗脫條件最為溫和，而Cell-Tuc-DVS-MBI則需要較苛刻的條件。采用簡化了的擴(kuò)散模型可以擬合吸附動(dòng)力學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)有效擴(kuò)散系數(shù)相對(duì)較小，且隨pH和鹽濃度變化。蛋白質(zhì)穿透實(shí)驗(yàn)表明，功能化介質(zhì)可用于固定床或擴(kuò)張床吸附分離。 疏水性電

9、荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)的應(yīng)用——卵黃免疫球蛋白的分離：選用Cell-TuC-AB-MEP作為層析介質(zhì)，從卵黃稀釋液中分離免疫球蛋白IgY，考察了層析條件對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，采用固定床或擴(kuò)張床操作模式，均可實(shí)現(xiàn)IgY的有效分離。固定床層析時(shí)，收率為58.4％，純化因子2.9，純度達(dá)到了92％；而擴(kuò)張床吸附層析時(shí)，流速高達(dá)500cm/h，收率為48.4％，純化因子2.9，純度仍有89％。結(jié)果驗(yàn)證了所制備的HCIC功能化介質(zhì)具有良好的IgY吸