恥垢分枝桿菌ligD和ku突變株的構(gòu)建.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)可引起結(jié)核病，是微生物中人類(lèi)最大的敵人，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)全球三分之一的人口感染了MTB，WHO的數(shù)據(jù)顯示，2011年全球新發(fā)現(xiàn)有870萬(wàn)感染者患病，其中有110萬(wàn)患者同時(shí)感染艾滋病毒，估計(jì)有140萬(wàn)人死于結(jié)核病。因與艾滋病毒共同感染人體造成死亡的數(shù)目之巨，MTB已成為傳染病中的頭號(hào)殺手。雖然現(xiàn)己開(kāi)發(fā)幾種抗結(jié)核類(lèi)藥物但由于耐藥性的產(chǎn)生，這些藥物的控制效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到

2、令人滿意的效果。結(jié)核病是一個(gè)從未解決的麻煩。
　　 DNA雙鏈斷裂是普遍存在的一種DNA損傷，但其對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是致命的。修復(fù)DNA雙鏈斷裂的途徑有同源重組(homologousrecombination，HR)和非同源末端連接(non-homologousend-joining，NHEJ)。NHEJ最早是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，并一直被認(rèn)為只存在于真核生物中，其在真核生物中對(duì)保持基因組的穩(wěn)定性有很重要的作用。但之后的研究發(fā)現(xiàn)NH

3、EJ也普遍存在于一些病原微生物中，且與耐藥和免疫逃避相關(guān)。
　　 現(xiàn)已知NHEJ修復(fù)途徑涉及兩個(gè)蛋白LigD和Ku，同時(shí)對(duì)這兩個(gè)蛋白的功能也有了一定的了解，而在NHEJ修復(fù)過(guò)程中，LigD同Ku的作用機(jī)制及調(diào)控方式還不是很明確。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)去乙?；窼ir2可能參與NHEJ修復(fù)途徑，還發(fā)現(xiàn)Ku的29位賴氨酸有乙?；揎棧@暗示了NHEJ修復(fù)的調(diào)控可能同Ku的K29乙?；揎椨嘘P(guān)。
　　 我們以恥垢分枝桿菌做為模式

4、生物使用無(wú)標(biāo)記基因敲除法來(lái)構(gòu)建ligD和ku兩個(gè)基因的不同突變體ligD△PolDom、TBku-his、ku-his、kuR29-his和kuQ29-his。無(wú)標(biāo)記基因敲除需要兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)質(zhì)粒為plNIL，為目的基因提供多克隆位點(diǎn)，第二個(gè)質(zhì)粒pGOAL，含有一個(gè)兩端為PacⅠ酶切位點(diǎn)的標(biāo)記基因盒。標(biāo)記基因盒里有抗生素抗性基因、lacZ和sacB。構(gòu)建成的自殺質(zhì)粒含有pGOAL質(zhì)粒的標(biāo)記基因盒和修飾過(guò)的目的基因，最后經(jīng)過(guò)兩次篩選得到我