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文檔簡介
1、已經(jīng)證明,血管活性物質及其受體、細胞因子及其受體和細胞信號轉導分子所構成的復雜網(wǎng)絡調節(jié)血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)的功能。近年發(fā)現(xiàn),全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)及其受體以直接或間接的方式參與VSMC生物學行為的調節(jié)。
Krüppel-likefactor4(KLF4)是一類具有鋅指結構的轉錄因子,廣泛參與多種細胞的生長、增殖、分化及凋亡
2、的調節(jié)。
Mfn-2(亦稱為增殖抑制基因,HSG)是一種線粒體融合蛋白,主要在高能量需求的組織,如骨骼肌和心肌中表達。本研究利用現(xiàn)代分子生物學和細胞生物學實驗技術,研究KLF4在ATRA誘導mfn-2表達中的作用及作用機制,發(fā)現(xiàn)在VSMC中,KLF4通過直接與mfn.2啟動子結合激活mfn.2表達,ATRA通過激活JNK和p38MAPK信號通路使KLF4磷酸化,磷酸化型KLF4與p300結合并被其乙?;LF4乙酰化后與
3、mfn-2啟動子的結合活性增強。另外,在ATRA處理的VSMC中,RARα與KLF4共同激活mfn-2啟動子。
1.KLF4介導ATRA誘導的mfn-2表達ATRA可同時上調KLF4和mfn-2表達,但KLF4在ATRA誘導mfn-2表達中的作用尚不清楚。本部分旨在探討KLF4是否介導ATRA誘導的mfn-2表達。實驗結果如下:
1.1KLF4介導ATRA對mfn-2表達的誘導作用RT-PCR和Western
4、blot結果顯示,ATRA可顯著誘導KLF4和mfn-2表達,并具有明顯的時效關系。其中,ATRA濃度為10μM和作用時間為24h時兩者的表達變化最明顯。
1.2KLF4直接結合到mfn-2啟動子上并調節(jié)其轉錄為了明確KLF4是否直接激活mfn-2啟動子,用mfn-2報告基因(pGL3-mfn-2-luc)和KLF4表達質粒共轉染A293細胞,熒光素酶活性分析結果顯示,過表達KLF4以劑量依賴的方式增加mfn-2啟動子活性
5、。
1.3KLF4介導ATRA誘導的線粒體成簇和線粒體去極化為了分析mfn-2表達上調對VSMC線粒體動力學的影響,分別用熒光染色和電鏡觀察ATRA處理和KLF4過表達所引起的線粒體形態(tài)變化。
以上結果表明,mfn-2是受KLF4調控的靶基因,在VSMC中,KLF4介導ATRA誘導的mfn-2表達,提示KLF4在ATRA信號通路中發(fā)揮重要作用。
2.KLF4對mfn-2的轉錄激活與ATRA誘導K
6、LF4與p300相互作用及KLF4乙?;嚓P聯(lián)KLF4的轉錄活性受與之相互作用的輔助因子以及翻譯后修飾如磷酸化、乙?;榷喾N方式的影響。本部分實驗探討ATRA對KLF4磷酸化和乙?;揎椀挠绊?,并研究這些修飾在KLF4調節(jié)mfn-2表達中的意義。
2.1ATRA誘導KLF4乙?;癁榱岁U明ATRA促進KLF4激活mfn-2轉錄的分子機制,本部分實驗首先檢測ATRA對KLF4乙?;挠绊?。實驗結果表明,隨著VSMC被ATRA刺
7、激時間的延長,KLF4乙?;街饾u升高。
2.2ATRA通過激活JNK和p38信號通路誘導KLF4磷酸化以及KLF4與p300的相互作用為了明確KLF4與p300相互作用是否依賴于KLF4磷酸化,我們檢測ATRA對KLF4磷酸化的影響。實驗結果表明,ATRA刺激VSMC0.5h,KLF4的磷酸化水平開始升高,到1h達到高峰,并維持在此水平至2h。在相同的實驗條件下,JNK和p38MAPK的磷酸化水平也顯著升高,但ATRA
8、刺激不影響Akt和ERK的磷酸化水平。分別以ERK特異性抑制劑PD98059、Akt特異性抑制劑LY294002、p38MAPK特異性抑制劑SB203580和JNK特異性抑制劑SP600125處理VSMC,阻斷ERK、Akt、p38MAPK或JNK信號通路的活化后,再以10μMATRA刺激細胞1h。
Westernblot結果顯示,SP600125和SB203580預處理可顯著抑制ATRA誘導的KLF4磷酸化,而PD980
9、59和LY294002對KLF4磷酸化無明顯影響。VSMC被KLF4磷酸化位點突變體轉染后,再以10μMATRA刺激細胞1h,與對照組(轉染野生型KLF4表達載體)相比,KLF4磷酸化水平明顯下降,同時,KLF4與p300的結合明顯減少。
為了闡明KLF4乙酰化是否依賴于它的磷酸化及其與p300的相互作用,用SB203580和SP600125處理VSMC或者用KLF4磷酸化位點突變體轉染VSMC后檢測KLF4的磷酸化水平。
10、結果顯示,這些抑制劑或KLF4磷酸化位點突變體在抑制KLF4磷酸化的同時,也使KLF4乙酰化水平顯著降低。
報告基因分析結果顯示,將KLF4磷酸化位點突變體和p300共轉染A293后,KLF4激活mfn-2啟動子的作用消失。另外,用SP600125和SB203580處理A293細胞或者用KLF4磷酸化位點突變體轉染A293細胞,在KLF4磷酸化受到抑制后,ATRA喪失對mfn-2啟動子的激活作用。
以上結果表
11、明,ATRA通過誘導KLF4磷酸化促進其與p300相互作用,以及KLF4乙?;?,乙?;蚄LF4對mfn-2的轉錄激活作用增強。
3.RARα通過與KLF4相互作用促進KLF4對mfn-2啟動子的激活ATRA既可通過其受體介導的信號轉導途徑調節(jié)轉錄因子的活性,也可通過調節(jié)受體與相關轉錄因子的相互作用而調節(jié)轉錄因子的轉錄激活作用。第二部分實驗已經(jīng)證實,KLF4通過JNK和p38MAPK信號途徑介導ATRA對mfn-2表達的誘
12、導作用,本部分實驗進一步探討維甲酸受體(RAR)在KLF4激活mfn-2表達中的作用。
3.1ATRA誘導RARα和RARβ的表達ATRA能否誘導VSMC表達RAR目前尚不清楚。為了闡明RAR在KLF4介導mfn-2基因表達中的作用,首先檢查ATRA對RAR表達的影響。Westernblot和RT-PCR結果顯示,ATRA以時間和劑量依賴的方式顯著誘導RARα表達,輕微上調RARβ表達,對RARγ的表達沒有影響。
13、 3.2RARα通過與KLF4結合參與ATRA誘導KLF4乙酰化的過程因為在mfn-2啟動子區(qū)不存在RAR結合元件,因此,我們推測,RAR可能通過與KLF4相互作用或通過影響KLF4修飾間接調節(jié)mfn-2的表達。我們首先用RARα拮抗劑(Ro41-5253)和RARβ拮抗劑(LE135)處理VSMC或將靶向RAR的小干擾RNA(siRNA)導入VSMC,抑制內源性RAR表達后,進一步研究RAR對KLF4修飾的影響。Westernbl
14、ot結果顯示,RARα和RARβ拮抗劑不影響ATRA誘導的KLF4磷酸化。用RARα-siRNA敲低RARα表達顯著抑制KLF4乙?;?,敲低RARβ和RARγ對KLF4乙?;瘺]有影響。為了闡明RAR促進KLF4乙?;臋C制,我們檢測KLF4與RAR的相互作用。免疫共沉淀分析結果證實,ATRA僅促進KLF4與RARα的結合。
3.3RARα促進KLF4對mfn-2啟動子的激活報告基因分析結果表明,與單獨過表達KLF4相比,共
15、表達RARα和KLF4顯著增強KLF4對mfn-2啟動子的激活作用,共轉染RARα和KLF4表達載體后,再以ATRA刺激細胞可使mfn-2啟動子活性進一步升高。然而,在單獨過表達RARα條件下,無論ATRA刺激與否,均不能增強mfn-2啟動子活性。
3.4RARα與KLF4相互作用依賴于KLF4磷酸化上述實驗證實,KLF4與p300相互作用依賴于KLF4磷酸化。本部分實驗進一步檢查KLF4磷酸化是否影響其與RARα結合。免
16、疫共沉淀分析結果證實,用SP600125和SB203580處理VSMC或者用KLF4磷酸化位點突變體轉染VSMC后,ATRA誘導的RARα與KLF4的相互作用顯著降低。結果表明,RARα與KLF4相互作用依賴于KLF4的磷酸化。
3.5敲低RARα表達抑制KLF4與p300結合為了進一步明確RARα促進KLF4乙?;姆肿訖C制,將靶向RARα的小干擾RNA導入VSMC,阻斷ATRA誘導的內源性RARα表達后,檢查RARα對
17、KLF4與p300相互作用的影響。免疫共沉淀分析結果顯示,敲低RARα表達顯著抑制KLF4與p300的結合。
以上結果顯示ATRA通過誘導KLF4磷酸化而促進KLF4與RARα的結合,二者的結合有利于KLF4與p300的相互作用及KLF4被p300乙酰化,乙酰化型KLF4對mfn-2啟動子的激活作用顯著增強。
結論
1.KLF4介導ATRA誘導的mfn-2表達是通過與mfn-2啟動子區(qū)的KLF4
18、結合位點相互作用而實現(xiàn)的。同時,KLF4介導ATRA對核周線粒體成簇及線粒體去極化的誘導作用。
2.ATRA通過激活JNK和p38MAPK信號途徑而誘導KLF4磷酸化,磷酸化型KLF4與p300相互作用增強并被p300乙?;?。KLF4乙?;茿TRA激活mfn-2啟動子的重要條件。
3.ATRA通過誘導KLF4磷酸化而促進KLF4與RARα的結合,二者的結合有利于KLF4與p300相互作用,進而促進KLF4乙
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