AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和Mn-SOD-ADSCs對(duì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)作用及其線粒體機(jī)制.pdf

1、目的:研究晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能的影響，損傷內(nèi)皮細(xì)胞與Mn-SOD修飾的脂肪干細(xì)胞（Mn-SOD-ADSCs）共培養(yǎng)后的修復(fù)情況，探索AGEs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的線粒體相關(guān)機(jī)制和Mn-SOD-ADSCs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的救助效果及可能的機(jī)制，為脂肪干細(xì)胞移植手段應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥的治療提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:以不同濃度（50，1

2、00μg/mL）的AGE-BSA處理細(xì)胞株人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells，HAECs)48 h，CCK-8法測定HAECs細(xì)胞的增殖活性，TBA法和黃嘌呤氧化酶法分別測定細(xì)胞MDA含量及SOD活力，DCFH-DA探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平，分析AGEs對(duì)細(xì)胞氧化還原水平的影響;JC-1法檢測細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)，熒光素-熒光素酶法和Clark氧電極法分別測定細(xì)胞中ATP的含

3、量和細(xì)胞的耗氧率，MitoTracker Red染色法檢測線粒體數(shù)量，分析線粒體功能的變化;Western blot檢測心磷脂?；D(zhuǎn)移酶(ALCAT1)及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)水平。為了驗(yàn)證細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，應(yīng)用植環(huán)法分離培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rat aorticendothelial cells，RAECs)，再用熒光免疫法對(duì)其進(jìn)行鑒定，CCK-8法測定AGE-BSA（50μg/mL）對(duì)RAE

4、Cs細(xì)胞增殖活性的影響，并檢測一系列與細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)相同的指標(biāo)，包括氧化應(yīng)激指標(biāo)、線粒體功能相關(guān)指標(biāo)以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測。分離培養(yǎng)rADSCs，使用pAV-MCMV-SOD2-3Flag-IRES2-EGFP重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染rADSCs，使rADSCs過表達(dá)線粒體特有的超氧化物歧化酶SOD2(即Mn-SOD);Mn-SOD-rADSCs再與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，測定線粒體相關(guān)的指標(biāo)，包括使用MitoSOX Red染色檢測線粒體來源的ROS

5、水平、熒光素-熒光素酶法和Clark氧電極法分別測定細(xì)胞中ATP的含量和細(xì)胞的耗氧率;MitoTracker Red染色法觀察過表達(dá)SOD2（即Mn-SOD）與線粒體共定位情況，活細(xì)胞工作站記錄共培養(yǎng)細(xì)胞之間的TNT樣結(jié)構(gòu)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)情況。
　　結(jié)果:在第一部分研究中，發(fā)現(xiàn)AGE-BSA作用可以引起HAECs氧化應(yīng)激損傷，通過CCK-8法檢測及倒置相差顯微鏡觀察，AGE-BSA濃度依賴性地抑制HAECs細(xì)胞的增殖，AGE-BSA能夠

6、提高細(xì)胞氧化水平，包括細(xì)胞MDA含量的增加、SOD活力的下降以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高;AGE-BSA能夠誘導(dǎo)HAECs線粒體功能發(fā)生紊亂:線粒體膜電位(MMP)下降、ATP產(chǎn)生明顯減少、細(xì)胞耗氧能力的下降，同時(shí)AGE-BSA還能夠引起線粒體斷裂的增多;另外AGE-BSA可以上調(diào)ALCAT1的表達(dá);AGE-BSA還能夠引起細(xì)胞發(fā)生凋亡:Bcl-2表達(dá)量下降、Bax表達(dá)量明顯上升以及Caspase-3表達(dá)水平下降。第二部分首先成功培養(yǎng)出R

7、AECs，3-4天細(xì)胞從血管環(huán)爬出，8-9天細(xì)胞融合成單層，鏡下呈鋪路石狀排列，經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色后，發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)胞核周圍出現(xiàn)紅色熒光陽性反應(yīng)，確定所培養(yǎng)細(xì)胞屬于內(nèi)皮細(xì)胞;AGE-BSA作用后同樣能夠引起RAECs氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能發(fā)生紊亂，并出現(xiàn)凋亡，與第一部分結(jié)果相一致。第三部分，使用pAV-MCMV-SOD2-3Flag-IRES2-EGFP重組腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染rADSCs，倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示細(xì)胞絕大部

8、分顯示綠色熒光，轉(zhuǎn)染率達(dá)95％以上;與Mn-SOD-ADSCs共培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，損傷內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體來源的ROS水平下降、細(xì)胞內(nèi)ATP含量及細(xì)胞耗氧率均有所升高，說明共培養(yǎng)可以使得損傷內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能得到修復(fù);MitoTracker Red染色，倒置熒光顯微鏡觀察到Mn-SOD-ADSCs中過表達(dá)的SOD2（即Mn-SOD）與線粒體基本共定位，活細(xì)胞工作站觀測結(jié)果顯示共培養(yǎng)時(shí)，Mn-SOD-ADSCs與損傷RAECs之間存在TN

9、Ts樣結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)有線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　結(jié)論:AGE-BSA能夠使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷和線粒體功能紊亂，引發(fā)細(xì)胞凋亡;與Mn-SOD-rADSCs共培養(yǎng)能夠改善損傷內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體的功能，其可能機(jī)制之一是通過兩種細(xì)胞間的TNTs樣結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)過表達(dá)Mn-SOD的線粒體起到了救助作用?？傊?，AGE-BSA損傷內(nèi)皮細(xì)胞過程中線粒體起著重要作用，TNTs可能是干細(xì)胞治療的新機(jī)制，為ADSCs移植應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥治療的研究提供了新的理論