TiO2納米管抗菌與生物活性雙功能種植體涂層的構(gòu)建與評價.pdf

1、【背景】
　　牙科種植技術已成為牙列缺損或缺失的重要修復方法之一，但牙種植體相關感染仍是嚴重威脅，帶來一系列并發(fā)癥。種植體相關感染高發(fā)的原因主要有兩點：一是菌斑容易在種植體表面聚集且一旦形成很難去除；二是由于種植體的生物活性尚不理想，在種植體骨結(jié)合界面存在乏血管的纖維層使局部宿主抵抗力低下。因此，針對這兩點在種植體表面制備同時具有抗菌和高生物活性雙功能的涂層對于預防種植體相關感染，延長其使用壽命具重要意義。
　　人體自然組織

2、是由納米模塊組裝起來的，因此從仿生學的角度來看納米結(jié)構(gòu)應該具有更好的生物活性。二氧化鈦（TiO2）納米管（NT）制備工藝簡單而且它用電化學處理制備，適合應用于形狀復雜的種植體表面。TiO2-NT的管徑可在幾十到幾百納米范圍內(nèi)變化，有利于篩選適合不同組織結(jié)合的納米尺寸。此外，TiO2-NT結(jié)構(gòu)能夠模擬骨組織中膠原原纖維的尺寸和排列，并且具有和骨組織相近的彈性模量。因此，通過優(yōu)化TiO2-NT結(jié)構(gòu)有希望獲得理想的生物活性。
　　阻止種

3、植體表面生物膜形成最有效的辦法是預防細菌的早期粘附，因為生物膜一旦形成很難去除。從這個角度出發(fā)，抗菌涂層特別是載抗菌劑的涂層是一個有效途徑。TiO2-NT很好的一個優(yōu)點是它可作為藥物的載體，因此通過載入合適的抗菌劑可獲得抗菌能力。多種不同的抗生素都被嘗試用于抗菌涂層的制備，但抗生素的使用所帶來的產(chǎn)生耐藥菌株的風險嚴重限制了它們的應用。經(jīng)過文獻回顧我們認為銀是制備抗菌涂層的較為理想的選擇。銀具有多方面的優(yōu)點如廣譜抗菌能力甚至包括某些抗生素

4、耐藥菌、在合適的濃度時很好的生物相容性、良好的穩(wěn)定性以及產(chǎn)生耐藥菌的風險小等。此外，由于銀抗菌的有效濃度很低，可以通過在TiO2-NT中載入足夠多的銀和控制釋放速度獲得長期抗菌能力。
　　【目的】
　　探明影響TiO2-NT生物活性的因素，基于TiO2-NT篩選和研發(fā)具有更好生物活性的結(jié)構(gòu)；探索納米結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細胞功能的機制，為進一步指導種植體表面設計提供理論基礎；摸索合適的方法將銀載入TiO2-NT中以獲得長期抗菌能力；鑒于干

5、細胞在骨結(jié)合中的更重要的作用，研究TiO2-NT與干細胞的相互作用，為更合理的種植體表面設計提供依據(jù)；體內(nèi)試驗驗證這些結(jié)構(gòu)的效果。
　　【方法】
　　1）用陽極氧化方法在0.5wt％氫氟酸（HF）溶液中制備TiO2-NT，場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）觀察制備的TiO2-NT的管徑大小、管的完整性和膜的均勻程度等。觀察陽極氧化電壓和時間對形成的TiO2-NT的影響；2）采用大鼠原代成骨細胞體外培養(yǎng)的方法評價5VTiO2-NT

6、（5VNT）和20VNT的生物活性。檢測不同電壓所形成的TiO2-NT的表面能差異，用DAPI染細胞核然后計數(shù)細胞粘附，MTT法測細胞活性，免疫熒光染色和SEM觀察細胞形態(tài)，試劑盒檢測細胞堿性磷酸酶（ALP）活性，實時定量PCR檢測成骨相關基因的表達；3）評價5VNT和20VNT經(jīng)高溫高壓、紫外照射和酒精浸泡消毒后生物活性的差異。測量不同方法消毒后試樣表面能的差異，試劑盒檢測其蛋白吸附能力以及細胞培養(yǎng)液中LDH活性，用前面述及的方法檢測

7、細胞粘附、活性、胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量以及成骨相關基因的表達，天狼星紅染色法檢測細胞膠原分泌，茜素紅染色法檢測細胞外基質(zhì)（ECM）礦化；4）采用酸蝕加陽極氧化處理的方法制備微米坑/納米管梯度形貌，并用體外成骨細胞培養(yǎng)的方法評價該仿生梯度形貌的生物活性；5）以成分為碳化鈦/碳殼核結(jié)構(gòu)（TiC/C）或表面成分為TiO2的準平行豎直排列的納米線陣列(QANWAs)為模型，用體外成骨細胞培養(yǎng)的方法探索納米結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細胞功能的機制；6）硝酸銀浸

8、泡加光照還原的方法將銀納米顆粒載入TiO2-NT中，控制硝酸銀的濃度和浸泡時間載入不同量的銀，體外評價其長期抗菌能力和生物相容性；7）體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs），觀察TiO2-NT以及微米/納米梯度結(jié)構(gòu)在無成骨誘導培養(yǎng)基（OS）的情況下對MSCs成骨分化的影響。CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞周期，觀察細胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量、膠原分泌和ECM礦化和基因表達水平。阻斷ERK1/2、JNK和PI3K/Akt信號

9、通路后觀察膠原分泌和ECM礦化；8）觀察OS對鈦和細胞培養(yǎng)板（TCP）表面培養(yǎng)的MSCs成骨分化的影響；9）體內(nèi)試驗驗證試樣的體內(nèi)效果。
　　【結(jié)果】
　　1）成功制備均勻分布的TiO2-NT結(jié)構(gòu)，管徑與陽極氧化電壓正相關，在3-20V的電壓下進行陽極氧化分別形成管徑20-100nm的TiO2-NT陣列；2）在TiO2-NT表面早期細胞粘附未受明顯影響，與拋光鈦相比TiO2-NT提高成骨細胞ALP活性并誘導更多的ECM沉積。

10、細胞緊密地粘附到拋光鈦表面并且互相接觸，幾乎完全覆蓋整個表面，在5VNT表面細胞伸出結(jié)實的板狀偽足，而在20VNT表面細胞伸出大量纖細的絲狀偽足。細胞生長略受抑制，但細胞成骨相關功能基因的表達受到明顯抑制特別是在20VNT表面；3）與高溫高壓消毒相比，紫外照射和酒精浸泡消毒試樣的表面自由能較高，細胞粘附和增殖較好。其中紫外照射消毒表面的細胞功能最好，包括細胞粘附、增殖以及以ECM沉積及礦化和成骨相關功能基因的表達為標志的細胞分化。不同消

11、毒方法的使用影響對納米形貌和拋光對照之間的生物活性的對比。如高溫高壓消毒后TiO2-NT表面的細胞早期粘附數(shù)量較多，但當用紫外照射或酒精浸泡消毒時這一差異消失。當采用酒精浸泡消毒時20VNT表面的細胞增殖比其它兩個試樣好，但當采用紫外照射或高溫高壓消毒時三個試樣表面的細胞增殖無差異；4）成功制備微米坑/納米管梯度仿生形貌。發(fā)現(xiàn)酸蝕微米形貌對成骨細胞功能的促進作用不均衡，雖然細胞早期粘附和成骨相關功能基因的表達得到促進，但細胞其它功能被抑

12、制。在微米形貌上加入納米管之后同時促進或保持成骨細胞的多個功能；5）成功制備TiC/C和TiO2兩種不同表面成分的QANWAs，TiC/CQANWAs為超疏水性而TiO2QANWAs與光滑對照相比更加親水。QANWAs阻礙細胞粘附導致細胞凋亡，其它的細胞功能如增殖和分化也明顯受到抑制。QANWAs的細胞排斥特性主要來源于它們的特殊結(jié)構(gòu)，不受表面化學成分和表面潤濕性的影響，也并非源于蛋白吸附量的降低；6）通過硝酸銀浸泡加光照還原的方法成功

13、制備載銀納米管（NT-Ag），銀納米粒子緊密地粘附到納米管的內(nèi)壁，并且銀納米粒子的大小可以通過控制硝酸銀的濃度和浸泡時間來調(diào)整。NT-Ag在第一周內(nèi)可有效殺滅種植體周圍浮游細菌，而其預防活細菌粘附的能力在觀察的兩周內(nèi)無明顯下降；7）首次系統(tǒng)地觀察了TiO2-NT、酸蝕形貌、微米/納米梯度形貌在不使用OS的條件下對MSCs成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)所有的這些形貌均可在無OS的情況下誘導MSCs成骨分化。其中，20VNT和Micro/20VNT誘

14、導MSCs成骨分化的能力最強；8）在TCP表面OS的使用略微抑制MSCs增殖但明顯促進以膠原分泌和ECM礦化為代表的MSCs分化。而在鈦表面，OS仍就抑制MSCs增殖且該作用與TCP表面相比稍微明顯一些，但細胞分化并未像在TCP表面那樣受到促進而是遭到顯著抑制，細胞內(nèi)ALP活性和總蛋白含量、膠原分泌和ECM礦化均降低。OS在鈦表面對干細胞分化的抑制作用與其表面形貌無關；9）體內(nèi)預實驗結(jié)果表明20VNT在早期可促進種植體骨結(jié)合。
　

15、　【結(jié)論】
　　1）可以通過簡單的陽極氧化方法在鈦表面制備不同管徑（20-100nm）的TiO2-NT，從而可以篩選適合不同組織結(jié)合的納米尺寸。
　　2）TiO2-NT尤其是較大管徑的納米管抑制原代成骨細胞的某些功能如成骨相關功能基因的表達，原因在于TiO2-NT阻礙其表面細胞粘著斑的組裝。原代成骨細胞與細胞系表型的不一致使它們對TiO2-NT的反應不同，可能是目前關于TiO2-NT生物活性存在爭議的原因。
　　3）消

16、毒方法明顯影響TiO2-NT的表面特性從而影響其表面成骨細胞功能。各試驗中使用的不同消毒方法影響對納米形貌和拋光對照之間的生物活性的對比，提示消毒方法的不一致是目前關于TiO2-NT生物活性的報道出現(xiàn)爭議的一個重要原因。其中紫外照射消毒表面的細胞功能最好，原因在于紫外照射消毒能有效去除試樣表面的碳氫污染。
　　4）酸蝕微米形貌對成骨細胞功能的促進作用不均衡，在微米形貌上加入納米管之后更平衡地促進或保持成骨細胞的多個功能。該結(jié)果首次

17、揭示了微米和納米形貌對細胞功能的協(xié)同作用，提示微米/納米梯度結(jié)構(gòu)可能從生物學的角度來講更合理，這對種植體表面設計具有很大指導意義。
　　5）QANWAs阻礙細胞粘附導致細胞凋亡，原因可能在于對細胞粘著斑組裝的阻礙。該結(jié)果提示納米形貌包括TiO2-NT調(diào)控細胞功能的一個重要機制就是調(diào)節(jié)細胞粘附，包括整合素的簇集和粘著斑的組裝和成熟。
　　6）通過簡單的硝酸銀浸泡加光照還原的方法可以制備NT-Ag。載有適量銀的NT-Ag在早期一

18、周內(nèi)可有效殺滅種植體周圍浮游細菌，而其預防活細菌粘附的能力在觀察的兩周內(nèi)無明顯下降，提示NT-Ag的長效抗菌能力。雖然NT-Ag表現(xiàn)出一定的細胞毒性，但在接下來的試驗中我們可以通過縮小管口等方法控制銀的釋放速率以消除細胞毒性。
　　7）20VNT和微米/20VNT梯度形貌誘導干細胞成骨分化的能力最強。形貌因素的骨誘導能力源于它們對細胞粘著斑以及接下來的機械轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)。ERK1/2、JNK和PI3K/Akt均參加了微米/納米形貌表面