部分新型腸道病毒山東地方株全基因組分析及血清流行病學(xué)研究.pdf

1、[背景]
　　人類腸道病毒(Enteroviruses，EVs)型別眾多，通常以無癥狀的隱性感染為主，但也可引起急性弛緩性麻痹(Acute Flaccid Paralysis，AFP)、腦膜炎或腦炎、手足口病(Hand，F(xiàn)oot and Mouth Disease，HFMD)、急性出血性結(jié)膜炎、心肌炎、類感冒病癥等多種疾病，是重要的人類致病病原。
　　EVs基因組全長約7.5kb，為單股正鏈RNA，包括5'端非編碼區(qū)(5'-

2、nontranslated Region，5'NTR)，編碼多聚蛋白的單一開放讀碼框（Open Reading Frame,ORF）和3'NTR3個(gè)組成部分。1999年，Oberste等首次提出了基于EVVP1序列的分子生物學(xué)定型方法。傳統(tǒng)血清學(xué)方法無法定型的EVs陸續(xù)被鑒定出來，目前已分離到40多個(gè)新型EVs基因型。其原型株的全基因組多數(shù)已經(jīng)測序完成，但其他分離株的全基因組序列信息有限。EVs進(jìn)化活躍，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的新型EVs，如EV

3、-A76，EV-B74，EV-C96等，均有點(diǎn)突變和型內(nèi)重組發(fā)生。對新型EVs全基因組特征的分析，能夠全面掌握毒株的重組和進(jìn)化特點(diǎn)，并為基因組數(shù)據(jù)庫提供全面的序列信息，對于分析病毒在地區(qū)及全球的傳播情況提供參考依據(jù)。
　　新型EVs雖然發(fā)現(xiàn)較晚，但已與多起疾病暴發(fā)相關(guān)，如EV-A71已在東亞和東南亞地區(qū)引發(fā)數(shù)起HFMD大流行，成為全球的重大公共衛(wèi)生問題。另外，EV-B75、EV-A76和EV-A89與2006年印度、西班牙等國家的

4、病毒性腦炎暴發(fā)有關(guān)。某些新型EVs的感染還表現(xiàn)為發(fā)熱、消化道和/或呼吸道癥狀，常常不易鑒別，這給疾病的預(yù)防與早期診治帶來很大困難。進(jìn)行EVs血清流行病學(xué)研究能夠掌握人群中EVs抗體攜帶情況，了解人群的易感性和免疫水平的動(dòng)態(tài)變化，為疾病的預(yù)防提供參考依據(jù)。目前僅有少數(shù)新型EVs的血清流行病學(xué)研究報(bào)道。
　　[研究目的]
　　1.在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)對發(fā)現(xiàn)的部分新型EVs山東分離株(EV-A71C2亞型，EV-B74，EV-

5、B80，EV-B87)的全基因組特征進(jìn)行分析;
　　2.選擇部分新型EVs山東分離株（EV-A71C4亞型，EV-B87，EV-A90），對健康人群的血清中和抗體水平進(jìn)行檢測分析。
　　[研究方法]
　　1.對已經(jīng)鑒定出的新型EVs山東分離株(EV-A71C2亞型、EV-B74、EV-B80、EV-B87)進(jìn)行全基因組序列測定。
　　2.使用BioEdit7.1.7軟件，對新型EVs山東分離株與原型株間核苷酸、氨

6、基酸序列相似性進(jìn)行比對。
　　3.采用Mega4.0軟件，以鄰位法(Neighbor-joining Method)與同型分離株構(gòu)建P1、P2、P3區(qū)系統(tǒng)發(fā)生樹，對新型EVs山東分離株進(jìn)行進(jìn)化重組分析。
　　4.使用Simplot3.5.1軟件，分析新型EVs山東分離株與同型分離株在基因組中的重組。
　　5.選擇部分新型EVs山東分離株(EV-A71C4亞型，EV-B87，EV-A90)，對健康人群血清中和抗體水平進(jìn)行

7、檢測分析。
　　[主要結(jié)果]
　　1.新型EVs全基因組序列特征分析
　　全基因組序列特征分析顯示，EV-A74、EV-B80、EV-B87的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)均發(fā)現(xiàn)了基因重組的證據(jù)。在該區(qū)域，EV-A74山東株與E13和E19原型株序列同源性較高;EV-B80山東株與E19、E27和E13原型株序列同源性較高;EV-B87山東株與CVB2、EV-B85和EV-B98原型株序列同源性較高。EV-B80山東株相比其原型株，

8、在衣殼蛋白VP1編碼區(qū)3'端有36個(gè)核苷酸插入。插入位點(diǎn)正是不同基因型間衣殼蛋白編碼區(qū)長度變化的區(qū)域。
　　EV-A71C2亞型山東株96200的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，96200在P1、P2和P3區(qū)與EV-A71C2亞型的澳大利亞分離株7F/AUS/6/99、臺(tái)灣分離株NCKU9822、Tainan/5746/98/TW/1998和pinf7-54A均在同一分支;與類EV-A71C2亞型臺(tái)灣分離株2008-00643僅P1區(qū)在同一

9、分支，在P2和P3區(qū)分屬不同分支。Simplot同源重組分析發(fā)現(xiàn)，在P1、P2和P3區(qū)，96200與7F/AUS/6/99、NCKU9822、Tainan/5746/98/TW/1998和pinf7-54A序列相似性均超過90％;與2008-00643、EV-A71原型株BrCr及EV-A71山東地方株JN01/10的相似性，P1區(qū)明顯高于P2和P3區(qū)。
　　2.新型EVs血清流行病學(xué)分析
　　血清流行病學(xué)研究所用標(biāo)本來自2

10、010年脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體監(jiān)測用血清標(biāo)本，標(biāo)本來自10個(gè)年齡組，共計(jì)390份。EV-A71、EV-B87和EV-A90在人群中的抗體陽性率分別為46.0％、47.0％和8.8％。EV-A71、EV-B87和EV-A90在人群中的抗體陽性率與年齡關(guān)系較為密切，在7個(gè)月～2歲左右出現(xiàn)最低值，之后逐漸增高。
　　EV-A71、EV-B87和EV-A90在人群中幾何平均滴度(Geometric Mean Titer,GMT)分別為1∶

11、5.20、1∶4.02和1∶1.49，在7個(gè)月～2歲左右出現(xiàn)最低值，在5～14歲學(xué)齡段出現(xiàn)高值。3.5％的人群EV-A71的GMT≥1∶256，符合HFMD實(shí)驗(yàn)室診斷病例的標(biāo)準(zhǔn)。僅有0.3％的調(diào)查者出現(xiàn)EV-A90的GMT≥1∶256，無調(diào)查者出現(xiàn)EV-B87的GMT≥1∶256。
　　[主要結(jié)論]
　　1.本研究對EV-A71C2亞型以及EV-B74、EV-B80和EV-B87型山東地方株進(jìn)行了全基因組序列分析。除EV-B

12、74之外，其他均為國內(nèi)首次報(bào)道的全基因序列。
　　2.EV-A71C2亞型分離株在1996～1999年間較為保守，根據(jù)現(xiàn)有的基因組數(shù)據(jù)庫資料未發(fā)現(xiàn)重組的證據(jù)。相比1996～1999年的EV-A71C2亞型分離株，2008年臺(tái)灣類EV-A71C2亞型分離株2008-00643已經(jīng)發(fā)生了重組。
　　3.EV-B74、EV-B80、EV-B87山東分離株與其他EV-B組腸道病毒在P2和P3非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)發(fā)生重組。EV-B80的基

13、因組比對結(jié)果顯示，核苷酸的插入和缺失也是EV結(jié)構(gòu)蛋白基因進(jìn)化的機(jī)制之一。
　　4.7個(gè)月～2歲兒童EV-A71、EV-B87和EV-A90抗體陽性率最低，可能是EV的易感人群。
　　5.EV-B87可能與某些流行的EVs間存在交叉抗體反應(yīng)，人群中天然形成了EV-B87免疫屏障，由此推測EV87可能不會(huì)引發(fā)大范圍的流行。
　　6.EV-A90在人群中抗體陽性率較低，而全球和國內(nèi)分離毒株相對較多，涉及地理范圍廣，需要對其加