全人源抗c-Met Fab抗體的篩選及鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、c-Met是由原癌基因Met編碼的酪氨酸激酶受體,位于細(xì)胞膜上,包含1個(gè)50kDa的α亞基和1個(gè)150kDa的β亞基,兩者經(jīng)二硫鍵連接形成異二聚體。c-Met是肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor/scatter factor,HGF/SF)在體內(nèi)的唯一受體,兩者結(jié)合并隨之激活后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙和新血管生成,最終導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前HGF/SF和c-Met多種拮抗劑的研究已在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2、中證明可有效地抑制腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移,HGF/SF-c-Met已經(jīng)成為腫瘤診斷和生物治療的新靶點(diǎn)。鼠源抗HGF/SF和c-Met單克隆抗體和或/多克隆抗體已在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出高親和力和中和活性,但是鼠源性單克隆抗體引起的人抗鼠抗體反應(yīng)(humarn antimouse antibody,HAMA)限制了鼠源抗體在臨床中的應(yīng)用。這就推動(dòng)了人源化單克隆抗體的研究。與鼠源性單克隆抗體相比,人源化單克隆抗體免疫源性明顯減弱,并且血清半

3、衰期顯著延長,促進(jìn)了單克隆抗體在臨床中的應(yīng)用。本文利用固相篩選方法從大容量人源天然Fab抗體庫中篩選抗c-Met Fab抗體,并對其與人肝癌細(xì)胞的結(jié)合活性進(jìn)行鑒定,為研制用于肝癌生物治療的靶向藥物,提供候選分子。   材料與方法  1.以Met-Fc融合蛋白包板,擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)室制備的大容量人源天然Fab抗體庫(庫容為1.2×109)。將噬菌體抗體加入Met-Fc包被的ELISA板,進(jìn)行6輪洗脫、富集,從第6輪篩選后得到的細(xì)菌集落中

4、隨機(jī)挑取60個(gè)克隆,分別用Met-Fc、IgG包板,用Phage ELISA方法鑒定它們的免疫學(xué)特性。  2.可溶性表達(dá):用符合條件(Met-Fc(+)、IgG(-))的細(xì)菌克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Top 10F’,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)抗c-Met Fab抗體。誘導(dǎo)表達(dá)上清通過Protein L親和層析法純化。  3.用Western blotting、IP、FACS、免疫熒光等方法鑒定抗c-Met Fab抗體與c-Met表達(dá)陽性細(xì)胞

5、表面c-Met分子的結(jié)合活性。 結(jié)果: 1.用Met(c-28)兔抗Met多克隆抗體鑒定SMMC7721、BEL7402兩株肝癌細(xì)胞,結(jié)果顯示c-Met均表達(dá)于肝癌細(xì)胞表面。 2.經(jīng)過6輪Met-Fc固相篩選的噬菌體感染XL I-Blue大腸桿菌,隨機(jī)挑取60個(gè)克隆表達(dá),進(jìn)行Phage ELISA鑒定。其中54個(gè)克隆與Met-Fc呈陽性反應(yīng),陽性率為90%。54個(gè)克隆中與Fc呈陰性反應(yīng)者有4個(gè)克隆(AM1-1

6、4、AM2-9、AM2-18、AM2-26),BstOI酶切鑒定顯示為同一克隆,測序結(jié)果顯示為人Fab片段。 3.陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)上清經(jīng)Protein L親和層析純化得到抗c-Met Fab抗體, 經(jīng)SDS-PAGE電泳,在相對分子量26、34kDa處各出現(xiàn)一條條帶,經(jīng)Westem blotting檢測為人Fab片段。 4.IP、FACS、免疫熒光結(jié)果顯示AM2-26可與SMMC7721、BEL740

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