腦脊液對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷是脊柱骨折的嚴(yán)重并發(fā)癥，是困擾臨床醫(yī)生的一大難題。人類神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)成功，為脊髓損傷的治療提供了一條新的思路，使脊髓損傷恢復(fù)變?yōu)榭赡?。神?jīng)干細(xì)胞已經(jīng)有成熟的體外培養(yǎng)體系，但是，如何將體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞移植于體內(nèi)存活且生長，代替損傷組織重建損傷的脊髓，恢復(fù)脊髓神經(jīng)功能，仍有很多復(fù)雜的技術(shù)問題未能解決。在成年哺乳動(dòng)物脊髓的室管膜、膜下區(qū)存在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，并且在脊髓損傷后出現(xiàn)大量反應(yīng)性增生。當(dāng)脊髓損傷后，通過對內(nèi)源性神經(jīng)

2、干細(xì)胞的定向分化調(diào)控，使其迅速分化為神經(jīng)元或再髓鞘化的少突膠質(zhì)細(xì)胞，代替損傷脊髓組織來重建損傷的脊神經(jīng)，形成神經(jīng)通路，恢復(fù)脊髓功能，是脊髓損傷治療的理想方法。腦脊液有營養(yǎng)和保護(hù)腦與脊髓的作用，其化學(xué)成分與腦脊髓組織細(xì)胞外液的成分大致相同。已有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞能在腦脊液中均能存活、增殖和分化；向側(cè)腦室中注射神經(jīng)生長因子可使損傷的腦組織中內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖加快并向神經(jīng)元分化；腦脊液對神經(jīng)元的形成及神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化起重要作用。

3、　　本實(shí)驗(yàn)第一部分研究成年大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化規(guī)律。通過選用成年健康Wistar大鼠42只，隨機(jī)分為正常對照組(A組，n=14)和脊髓損傷組(B組，n=28)。利用動(dòng)脈瘤夾壓迫法建立脊髓損傷動(dòng)物模型，于傷后1天、3天、1周、2周、3周、4周、8周進(jìn)行取材，觀察局部病理組織學(xué)改變及用免疫組織化學(xué)方法檢測局部脊髓組織在不同時(shí)段Nestin的陽性表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組只有極少數(shù)室管膜細(xì)胞胞漿內(nèi)Nestin表達(dá)陽性，且在不

4、同時(shí)間段Nestin表達(dá)無明顯變化。B組脊髓組織中Nestin于損傷后1天時(shí)有少量表達(dá)；3天時(shí)室管膜細(xì)胞Nestin表達(dá)明顯升高，1周達(dá)到高峰，與A組比較差異具有顯著性(P=0.000)；2周時(shí)開始下降，4周時(shí)很少有Nestin表達(dá)，8周時(shí)兩組Nestin的表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。說明正常成年大鼠脊髓組織中存在有內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，其主要存在于脊髓中央管周圍的室管膜及膜下區(qū)。當(dāng)脊髓損傷后這些內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)明顯增加，在損傷原

5、位增生、分化，但隨著時(shí)間的推移內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞逐漸減少。
　　本實(shí)驗(yàn)第二部分探討經(jīng)側(cè)腦室向腦脊液中注射堿性成纖維細(xì)胞生長因子或/和骨形成蛋白-2后，大鼠脊髓損傷部位內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化情況，了解脊髓損傷后腦脊液成分的改變對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響，為脊髓損傷的治療提供新方法。具體方法為選用成年健康Wistar大鼠60只，利用動(dòng)脈瘤夾鉗夾壓迫法建立脊髓損傷動(dòng)物模型。將其隨機(jī)分為4組：按分組通過腦室向腦脊液中注射不同物質(zhì)，

6、A組注射生理鹽水作為對照組；B組注射骨形成蛋白-2；C組注射堿性成纖維細(xì)胞生長因子；D組注射骨形成蛋白-2和堿性成纖維細(xì)胞生長因子組。于脊髓損傷后1周、2周、3周、4周、8周進(jìn)行取材，將脊髓組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法檢測，觀察并比較各組大鼠損傷脊髓組織中在不同時(shí)間段BrdU及Nestin的陽性表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后1周時(shí)，各組脊髓組織中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)；在脊髓損傷后2周時(shí)，A組損傷脊髓組

7、織中BrdU開始下降，B、C、D三組損傷脊髓組織中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多；在脊髓損傷后3周時(shí)，A組脊髓組織中BrdU染色陽性細(xì)胞明顯減少，B、C、D組中BrdU陽性細(xì)胞達(dá)到高峰，與A組比較差異具有顯著性(P=0.000)；在脊髓損傷后4周時(shí)，B、C、D三組損傷脊髓組織中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)開始減少；在第8周時(shí)，A組中BrdU幾乎無表達(dá)，B、C、D三組中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)仍有少量表達(dá)，與A組比較差異無顯著性(P>0.05)。脊髓組織中

8、Nestin陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)，在脊髓損傷后1周時(shí)，各組差異無顯著性(P>0.05)；在脊髓損傷后2周時(shí)，A組損傷脊髓組織中Nestin開始下降，B、C、D三組損傷脊髓組織中Nestin陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多；在脊髓損傷后3周時(shí)，B、C、D組中Nestin陽性細(xì)胞達(dá)到高峰；在脊髓損傷后4周時(shí)，B、C、D三組損傷脊髓組織中Nestin陽性細(xì)胞數(shù)開始減少，B組中下降的更明顯；在第8周時(shí)，A組中中Nestin陽性細(xì)胞幾乎無表達(dá)，B、C、D三組中B