二甲雙胍誘導(dǎo)AMPK磷酸化抑制消化道腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、近年來，消化道腫瘤的發(fā)病率、確診率和死亡率逐年升高，其中又以胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和胰腺癌為主。在中國，胃癌、結(jié)腸癌、肝癌在所有癌癥中的發(fā)病率位列第2-4名，而胰腺癌又因其早期診斷難、治療效果差和生存時(shí)間短，同樣引起了人們廣泛的關(guān)注。這些消化道腫瘤會(huì)引起患者營養(yǎng)不良、電解質(zhì)失衡、血糖控制差、頻繁入院進(jìn)行治療等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至造成死亡，增加了整個(gè)社會(huì)及患者的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。雖然針對(duì)癌癥的預(yù)防、診斷和治療技術(shù)不斷發(fā)展，并在一定

2、程度上抑制了這4種消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但其預(yù)后依然不盡如人意。所以，探究并掌握這些消化道腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，對(duì)于提高腫瘤治療效果和預(yù)后意義重大。
　　二甲雙胍是人們所熟知的針對(duì)2型糖尿病的臨床一線用藥，由山羊豆提取而來，其降糖機(jī)制大致分為抑制肝臟葡萄糖輸出，促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖和抑制腸道葡萄糖吸收三類。二甲雙胍價(jià)格低廉，目前全世界大約有1.2億糖尿病患者服用二甲雙胍控制血糖。除了治療2型糖尿病，二甲雙胍還被用于治療

3、多囊卵巢綜合癥、代謝綜合征和糖尿病預(yù)防。近年來，各種臨床證據(jù)表明，患有乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和頭頸部癌的2型糖尿病患者，在服用二甲雙胍后其總體生存率得到大幅提升。大量體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，二甲雙胍能夠抑制多種人體惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，包括胃癌、胰腺癌、甲狀腺髓樣癌和子宮內(nèi)膜癌。盡管二甲雙胍的抗癌作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，但是其對(duì)抗癌癥的機(jī)制卻一直沒有被完全闡明。
　　腺苷酸活化蛋白激酶是一種異源三聚體形的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物，由一個(gè)

4、α-催化亞基、一個(gè)β-調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)γ-調(diào)節(jié)亞基組成。AMPK的主要作用是應(yīng)答細(xì)胞外界的各種刺激并維持細(xì)胞內(nèi)能量的供求平衡，在細(xì)胞代謝中起到重要作用。二甲雙胍通過激活LKB1-AMPK-ACC信號(hào)通路，抑制肝臟糖異生，促進(jìn)脂肪酸氧化，從而降低血糖水平并提高胰島素敏感性。已有研究表明，二甲雙胍發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制之一，便是誘導(dǎo)AMPK磷酸化使其活化，致下游多個(gè)信號(hào)通路激活，抑制或促進(jìn)相關(guān)促癌或抑癌蛋白的表達(dá)，達(dá)到阻斷癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。然而，

5、二甲雙胍更多潛在的抑癌機(jī)制尚待發(fā)掘。
　　為了進(jìn)一步研究二甲雙胍抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，本課題利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究二甲雙胍誘導(dǎo)AMPK磷酸化后抑制消化道腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。在本課題中將進(jìn)行:1、二甲雙胍誘導(dǎo)AMPK磷酸化的作用研究。2、二甲雙胍抑制胃癌和胰腺癌增殖和侵襲的作用研究。3、二甲雙胍激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖能力的機(jī)制研究。4、二甲雙胍激活A(yù)MPK/Akt/FoxM

6、1信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制研究。
　　1.二甲雙胍誘導(dǎo)AMPK磷酸化的作用研究
　　目的:探究AMPK在腫瘤組織中的活性表達(dá)并驗(yàn)證二甲雙胍對(duì)于AMPK活性的調(diào)節(jié)作用
　　方法:收集人體胃癌及癌旁組織病理切片，對(duì)其進(jìn)行p-AMPK免疫組織化學(xué)染色，比較p-AMPK在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)水平。利用裸鼠種植瘤實(shí)驗(yàn)構(gòu)建胃癌細(xì)胞皮下瘤動(dòng)物模型，進(jìn)行二甲雙胍干預(yù)治療，隨后取皮下瘤組織

7、進(jìn)行p-AMPK免疫組織化學(xué)染色，比較二甲雙胍干預(yù)前后p-AMPK表達(dá)水平的變化，驗(yàn)證二甲雙胍對(duì)于AMPK活性的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:在人體胃癌組織中，p-AMPK的表達(dá)水平與癌旁正常組織相比較表達(dá)降低。經(jīng)過二甲雙胍干預(yù)治療后的裸鼠，其皮下瘤組織中p-AMPK的表達(dá)水平明顯高于未經(jīng)二甲雙胍干預(yù)的空白對(duì)照組。
　　結(jié)論:AMPK在胃癌組織中活性下降，提示其可能發(fā)揮抑癌作用。二甲雙胍能夠誘導(dǎo)AMPK磷酸化，提高AMPK在腫瘤組織

8、中的活性。
　　2.二甲雙胍抑制胃癌和胰腺癌增殖和侵襲能力的作用研究
　　目的:探究二甲雙胍對(duì)于胃癌及胰腺癌增殖和侵襲的干預(yù)作用
　　方法:配置不同二甲雙胍濃度的培養(yǎng)液分別對(duì)胃癌及胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，在一定時(shí)間后觀察癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞集落形成情況，并與空白對(duì)照組進(jìn)行比較。對(duì)二甲雙胍處理組和非處理組的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，24h后觀察劃痕寬度變化。利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理48h后的胃癌細(xì)胞的周

9、期變化。利用裸鼠種植瘤實(shí)驗(yàn)構(gòu)建胃癌細(xì)胞及胰腺癌細(xì)胞皮下瘤動(dòng)物模型，分別進(jìn)行二甲雙胍干預(yù)治療，觀察皮下瘤生長(zhǎng)情況并與空白對(duì)照組進(jìn)行比較。收集因患有2型糖尿病而服用二甲雙胍控制血糖的胃癌患者的病歷資料，統(tǒng)計(jì)其中位生存時(shí)間，與未使用二甲雙胍組進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:胃癌及胰腺癌細(xì)胞在經(jīng)過二甲雙胍干預(yù)處理后，癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力下降，下降程度與二甲雙胍濃度呈正相關(guān)。對(duì)二甲雙胍處理組和非處理組的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，24h后可見非處理

10、組劃痕寬度明顯小于二甲雙胍處理組。二甲雙胍處理組胃癌細(xì)胞的S周期含量顯著降低。使用二甲雙胍喂養(yǎng)的皮下瘤裸鼠，其腫瘤的生長(zhǎng)速度顯著降低。服用二甲雙胍控制血糖的2型糖尿病胃癌患者的中位生存時(shí)間高于未服用患者。
　　結(jié)論:二甲雙胍能夠抑制胃癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，降低癌細(xì)胞成瘤能力，影響胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，提高胃癌患者生存時(shí)間。
　　3.二甲雙胍激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖能力的機(jī)制研究
　　目

11、的:研究二甲雙胍抑制胃癌細(xì)胞增殖能力的內(nèi)在機(jī)制
　　方法:使用不同濃度的二甲雙胍對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行體外干預(yù)處理，收取并裂解細(xì)胞獲取細(xì)胞內(nèi)蛋白，通過Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)AMPK和mTOR及下游蛋白的活性和表達(dá)情況。利用裸鼠種植瘤實(shí)驗(yàn)構(gòu)建胃癌細(xì)胞皮下瘤動(dòng)物模型，進(jìn)行二甲雙胍干預(yù)治療，通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮下瘤組織內(nèi)AMPK和mTOR及下游蛋白的活性和表達(dá)情況。
　　結(jié)果: p-AMPK的表達(dá)隨二甲雙胍濃度的

12、升高而升高，p-mTOR的表達(dá)隨二甲雙胍濃度的升高而降低，其下游p-70S6K、pS6和p4E-BP1的表達(dá)亦降低。
　　結(jié)論:二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路，使下游一些促進(jìn)細(xì)胞增殖的靶蛋白表達(dá)降低，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。
　　4.二甲雙胍激活A(yù)MPK/Akt/FoxM1信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制研究
　　目的:研究二甲雙胍抑制胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及結(jié)腸

13、癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的內(nèi)在機(jī)制。
　　方法:使用不同濃度的二甲雙胍對(duì)胰腺癌、肝癌及結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的體外干預(yù)處理，收取并裂解細(xì)胞獲取細(xì)胞內(nèi)蛋白，通過Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)AMPK、Akt及FoxM1等蛋白的活性和表達(dá)情況。
　　結(jié)果:p-AMPK和E-cadherin的表達(dá)隨二甲雙胍的濃度及處理時(shí)間的升高而升高，p-Akt、FoxM1、β-catenin、cyclin B1、cyclin D1

14、、vimentin和N-cadherin的表達(dá)隨二甲雙胍的濃度及處理時(shí)間的升高而降低。
　　結(jié)論:二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK/Akt/FoxM1信號(hào)通路，使下游某些與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶蛋白表達(dá)升高或降低，從而抑制胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。經(jīng)過上述研究，本課題得到如下結(jié)論:
　　(1)AMPK在胃癌組織中活性下降，提示其可能發(fā)揮抑癌作用。二甲雙胍能夠誘導(dǎo)AMPK磷酸化，激發(fā)AMPK

15、活性，提高AMPK在腫瘤組織中的表達(dá)。
　　(2)二甲雙胍能夠抑制胃癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，降低癌細(xì)胞成瘤能力，影響胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，提高胃癌患者生存時(shí)間。
　　(3)二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路，使下游的70S6K、S6和4E-BP1蛋白的活性降低，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。
　　(4)二甲雙胍可以通過激活A(yù)MPK/Akt/FoxM1信號(hào)通路，使下游某些與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)