非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織Perilipin和ADRP表達(dá)及意義的初步研究.pdf

1、研究背景: 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合癥，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化，胰島素抵抗和遺傳易感性與其發(fā)病密切相關(guān)。隨著肥胖和糖尿病的高發(fā)，NAFLD現(xiàn)在已成為我國常見的慢性肝病之一，生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD在我國的發(fā)病率逐

2、年上升，嚴(yán)重危害人民的健康。有關(guān)NAFLD的病因?qū)W、預(yù)防和治療已經(jīng)成為目前的研究熱點。目前NAFLD的發(fā)病機制尚未完全明確，其中脂代謝異常是NAFLD發(fā)生的最主要機制。 脂滴包被蛋白(Perilipin)是脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴表面含量最多的一種可磷酸化蛋白，在低磷酸化水平可保護甘油三酯免受水解，在高磷酸化水平可促進甘油三酯高效水解。脂肪分化相關(guān)蛋白(adipocyte differentiation-related protein，A

3、DRP)是細(xì)胞內(nèi)脂肪積聚的一個特異指標(biāo)，不僅參與巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)的代謝，也參與肺泡II型細(xì)胞與纖維母細(xì)胞間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移，并具有保護細(xì)胞內(nèi)甘油三酯不被水解的屏障功能，并促進細(xì)胞對長鏈脂肪酸的攝取，從而提示Perilipin和ADRP基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞脂滴代謝的各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，是影響脂代謝過程的重要因素。目前有關(guān)Perilipin和ADRP參與NAFLD發(fā)生發(fā)展的研究鮮見文獻報道，亦不清楚其在脂滴合成過程中的確切作用。因此，本實驗采用高

4、脂誘導(dǎo)的方法建立NAFLD模型大鼠，并采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和免疫印跡法(Westernblotting，WB)觀察NAFLD大鼠肝組織Perilipin和ADRP的表達(dá)狀況，旨在探討脂代謝相關(guān)基因Perilipin和ADRP在NAFLD發(fā)生機制中的作用，為NAFLD的早期防治提供一個新的治療靶點。 目的:

5、研究NAFLD模型大鼠肝組織中的與脂代謝密切相關(guān)的Perilipin和ADRP基因在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的變化，探討它們在NAFLD發(fā)病機制中的作用和意義。 方法: 1.48只雄性Wistar大鼠，隨機分為2組：正常飲食對照組和NAFLD模型組，正常飲食對照組24只以普通飼料喂養(yǎng)，NAFLD模型組中24只大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD模型大鼠。每組設(shè)立4、8和12周3個時相點進行觀察(各時相點8只大鼠)。肝組織切

6、片行HE染色于光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變；采用生化試劑盒檢測大鼠血漿游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)和甘油三酯(Triglyceride，TG)、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)

7、的水平。采用RT-PCR技術(shù)檢測Perilipin和ADRP基因各組肝組織中mRNA水平；采用WB檢測Perilipin和ADRP基因在各組肝組織的蛋白水平；采用免疫組化染色技術(shù)研究Perilipin和ADRP蛋白在各組大鼠肝組織的分布和定位。 結(jié)果: 1、各組大鼠肝臟病理學(xué)改變 在NAFLD組，隨造模時間延長，其肝組織脂變程度越加嚴(yán)重。第4周光鏡可見肝小葉結(jié)構(gòu)稍顯紊亂，肝細(xì)胞索欠清晰，部分肝細(xì)胞胞漿疏松，有少量

8、脂滴存在；在第8周可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索模糊欠清晰，肝細(xì)胞明顯濁腫，大多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)中可見脂滴；在12周可觀察到肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞內(nèi)有較多脂滴存在，匯管區(qū)可見少許炎細(xì)胞浸潤。在上述各時相點，正常對照組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索完整，肝竇無擴張。 2、各組大鼠血漿FFA、TG和血清ALT、AST水平變化 在NAFLD組，隨造模時間的延長，其血漿FFA、TG和血清ALT、AST的水平呈增高趨勢，且各時相點進行組內(nèi)

9、比較，差異非常顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常對照組各時相點(4周、8周、12周)比較，NAFLD組血漿FFA、TG和血清ALT、AST濃度均顯著升高(P<0.01)。在正常對照組血漿FFA、TG和血清ALT、AST的水平無明顯變化。 3、各組大鼠肝組織Perilipin和ADRP免疫組化染色 Perilipin表達(dá)的陽性細(xì)胞均主要位于肝細(xì)胞胞膜，陽性顏色均呈棕褐色、淡黃色。在NAFLD組，隨造模時間的延長，P

10、erilipin陽性細(xì)胞數(shù)減少，陽性著色漸淡，且在各時相點進行組內(nèi)比較，差異非常顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與正常對照組各時相點比較，NAFLD組Perilipin的積分光密度(integrated optical density，IOD)明顯降低(P<0.01)，在正常對照組Perilipin陽性細(xì)胞染色分別為棕褐色。而ADRP表達(dá)的陽性細(xì)胞同樣主要位于肝細(xì)胞胞膜，陽性顏色均呈淡黃色、棕褐色。在NAFLD組，隨造模時間的延長，A

11、DRP陽性細(xì)胞數(shù)增多，陽性著色增強，且在各時相點進行組內(nèi)比較，差異非常顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與正常對照組各時相點比較，NAFLD組ADRP的IOD值則明顯增高(P<0.01)，在正常對照組ADRP陽性細(xì)胞染色分別為淡黃色。 4、各組大鼠肝組織Perilipin-mRNA和ADRP-mRNA水平 在NAFLD組，隨造模時間的延長，Perilipin-mRNA水平(Perilipin/β-actin)呈降低趨勢，

12、而ADRP-mRNA水平(ADRP/β-actin)呈增加趨勢，且它們在各時相點進行組內(nèi)比較，差異非常顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常對照組各時相點比較，NAFLD組IODPperlinpin/IODp-actm值明顯降低(P<0.01)，而IODADRP/IODβ-actin值則明顯增高(P<0.01)。在正常對照組Perilipin-mRNA和ADRP-mRNA水平無明顯變化。 5、各組肝組織Perilipin和AD

13、RP蛋白水平 在NAFLD組，隨造模時間的延長，Perilipin蛋白水平呈降低趨勢，而ADRP蛋白水平呈增加趨勢，且它們在各時相點進行組內(nèi)比較，差異非常顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與正常對照組各時相點比較，NAFLD組Perilipin的IOD值明顯降低(P<0.01)，而ADRP的IOD值則明顯增高(P<0.01)。在正常對照組Perilipin和ADRP蛋白水平無明顯變化。 6、各組大鼠肝組織Perilipi

14、n、ADRP表達(dá)與FFA、TG的相關(guān)性 在各個時相點，NAFLD組Perilipin-mRNA的水平與FFA、TG呈明顯負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r值分別為-0.748、-0.719，P<0.01)，其Perilipin蛋白與FFA、TG亦呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0，698，-0.666，P<0.01)。NAFLD組ADRP-mRNA的水平與FFA、TG呈顯著正相關(guān)(r分別為0.648，0.697，P<0.01)，其ADRP蛋白水平與FF

15、A、TG也呈顯著正相關(guān)(r分別為0.715，0.703，P<0.01)。 7、各組大鼠肝組織SOD、MDA變化 在NAFLD組，隨造模時間增加，其肝組織SOD活性呈降低趨勢，且各時相點進行組內(nèi)比較，差異非常顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與正常對照組各時相點的SOD值比較，NAFLD組的SOD值明顯降低(P<0.01)。在NAFLD組，隨造模時間增加，其肝組織MDA含量增加更加顯著，且各時相點進行組內(nèi)比較，差異非常顯著

16、有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與正常對照組各時相點的MDA值比較，NAFLD組的MDA值明顯升高(P<0.01)。在正常對照組SOD和MDA水平無顯著變化。 結(jié)論: 1.在NAFLD模型大鼠，其脂代謝相關(guān)基因Perilipin、ADRP在肝組織中的表達(dá)與FFA、TG存在顯著相關(guān)性，提示Perilipin、ADRP的異常表達(dá)與肝組織生化指標(biāo)的紊亂密切相關(guān)，相互協(xié)同，共同促成了NAFLD的發(fā)生； 2.在NAFLD模型