阿魏酸鈉洗脫支架的制備及生物學(xué)性能研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　缺血性腦血管疾病是高度致殘致死性疾病,占腦血管疾病的75％-85%,30%-60%的缺血性腦血管病的發(fā)生可歸因于頸動脈的狹窄,外科干預(yù)治療頸動脈狹窄的主要措施包括頸動脈球囊擴(kuò)張成形術(shù),頸動脈支架植入術(shù),頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)和搭橋手術(shù)。然而這些干預(yù)措施之后,再狹窄也隨之發(fā)生,血管管腔直徑逐漸減少,缺血癥狀再次出現(xiàn),甚至導(dǎo)致血管閉塞。因此術(shù)后再狹窄的發(fā)生嚴(yán)重影響了手術(shù)的遠(yuǎn)期收益和療效[1],再狹窄的發(fā)生相當(dāng)普遍,腦血

2、管,冠脈血管,腎動脈,及其他外周血管術(shù)后均會出現(xiàn)不同程度的狹窄。新生內(nèi)膜過度增生是球囊成形術(shù)后和支架植入術(shù)后再狹窄的主要病理特征[2]。新生內(nèi)膜增殖是指血管平滑肌大量增殖并進(jìn)入血管內(nèi)膜或中層結(jié)構(gòu),它是血管內(nèi)膜層受損后普遍存在的反應(yīng)。新生內(nèi)膜形成與許多因素有關(guān)。內(nèi)皮損傷是其中一個(gè)關(guān)鍵因素[3],光滑完整的內(nèi)皮層能降低血栓和動脈粥樣硬化的發(fā)生[4],內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞密切相關(guān),它調(diào)節(jié)著血管的收縮節(jié)律,并且通過一氧化氮、內(nèi)皮素和前列腺素等途

3、徑調(diào)節(jié)著平滑肌的增殖。平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換,分化型平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成分化程度較低的分泌型細(xì)胞(未分化或去分化型),其增殖和遷移能力增強(qiáng),這是新生內(nèi)膜形成的關(guān)鍵步驟之一[3]。
　　血管成形術(shù)是一種機(jī)械擴(kuò)張狹窄或阻塞血管,使血管通暢的手術(shù)技術(shù),病變血管狹窄和閉塞往往是由動脈粥樣硬化而導(dǎo)致。血管成形術(shù)是一種微創(chuàng)手術(shù),它通過球囊導(dǎo)管到達(dá)血管狹窄部位,充盈球囊壓迫粥樣硬化斑塊,使斑塊壓縮至血管壁,然后回撤塌陷球囊,開放血管恢復(fù)血流。支架可

4、以在球囊擴(kuò)張的時(shí)候一并放入以維持血管開放狀態(tài)。為降低再狹窄發(fā)生率,血管支架在不斷改進(jìn),生物學(xué)性能也更加優(yōu)秀。支架由最初的裸金屬支架,演化出涂層支架,藥物洗脫支架和可降解支架等。藥物洗脫支架已成為心血管介入手術(shù)中應(yīng)用較為廣泛的植入器械。紫杉醇、雷帕霉素及其類似物被用于藥物洗脫支架,有效抑制了平滑肌增殖,但是這些不可控、非特異的影響細(xì)胞周期的藥物也明顯抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長,阻止內(nèi)皮重新愈合,導(dǎo)致晚期血栓形成和晚期支架內(nèi)再狹窄[5-11]

5、。許多其他藥物也被試驗(yàn)性的用于涂層支架,其目的是減少再狹窄和血栓的發(fā)生,可是效果并不理想。例如,皮質(zhì)類固醇激素地塞米被用于治療炎癥、免疫疾病,還能抑制平滑肌細(xì)胞增殖[12],但是臨床研究顯示地塞米松洗脫支架并不能有效抑制再狹窄。BENESTENT II試驗(yàn)對肝素涂層支架的抗再狹窄作用進(jìn)行了評估,結(jié)果表明肝素涂層支架的促凝性明顯降低,但是并沒抑制新生內(nèi)膜增生,對再狹窄沒有改善[13]。由于支架植入術(shù)后病人需長期口服抗血小板藥物,肝素涂層支

6、架實(shí)際作用受到質(zhì)疑。磷酸膽堿是細(xì)胞膜的主要成分,具有良好的血液相容性和組織相容性。將磷酸膽堿涂層支架植入實(shí)驗(yàn)動物(兔和豬)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)既沒有促進(jìn)新生內(nèi)膜增生,也沒有抑制再狹窄[14]。理想的藥物涂層應(yīng)能抑制平滑肌增生,同時(shí)促進(jìn)內(nèi)皮生長、愈合;完整光滑功能良好的內(nèi)皮也是防止血栓形成的重要條件。因此,重視內(nèi)皮功能恢復(fù)就有可能降低再狹窄率發(fā)生[15-17],新的有效藥物成為研究的熱點(diǎn),同時(shí)也是臨床治療的關(guān)鍵。
　　阿魏酸是一種源于植物的酚酸

7、,它及其鈉鹽形式阿魏酸鈉(sodium ferulate,SF)有多重生物學(xué)作用,包括抗腫瘤[18],抗動脈粥樣硬化[19,20],抗血小板[21,22],抗氧化,抗炎[23,24]。然而目前阿魏酸鈉對內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究較少,其作用機(jī)制仍不清楚。本研究利用細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)觀察、探討了SF對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響,為SF抗再狹窄作用的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ);然后將阿魏酸鈉和4種多聚物載體相結(jié)合,用浸涂法制作阿魏酸鈉多聚物涂層

8、支架,在顯微鏡及電鏡下觀察自制涂層支架表面形態(tài)學(xué),利用高效液相色譜技術(shù)測量藥物緩釋動力學(xué),體外實(shí)驗(yàn)檢測血液相容性,為動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用不同濃度阿魏酸鈉處理細(xì)胞,分為6組,對照組0μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml和1000μg/ml,在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),即處理24小時(shí)和48小時(shí),用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。同樣,采用劃痕愈合試驗(yàn)觀察不同藥物

9、濃度對細(xì)胞遷移能力的影響。采用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot觀察細(xì)胞內(nèi)叉頭蛋白M1(FoxM1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。
　　另一方面,用浸涂法制作阿魏酸鈉多聚物涂層支架,顯微鏡和掃面電鏡下觀察阿魏酸鈉多聚物涂層支架的表面形態(tài);高效液相色譜測量自制涂層支架阿魏酸鈉的釋放量;通過溶血率、凝血酶原時(shí)間和活化部分凝血活酶時(shí)間實(shí)驗(yàn),檢測自制涂層支架血液相容性。
　　結(jié)果:
　　1.阿魏酸鈉處理HUVECs

10、24小時(shí)后,在10μg/ml和100μg/ml處理組,細(xì)胞活性與對照組相比明顯提高;48小時(shí)后,細(xì)胞增殖趨勢更加明顯,在0.1-100μg/ml組細(xì)胞活性與對照組相比明顯提高,然而在1000μg/ml處理組,細(xì)胞活性降低明顯(P<0.05)。
　　2.處理12小時(shí),在1-100μg/ml組中,細(xì)胞遷移能力與對照組相比增強(qiáng);處理24小時(shí)后,在0.1-100μg/ml組中,細(xì)胞遷移能力與對照組相比明顯增強(qiáng);處理48小時(shí)后,在0.1-1

11、00μg/ml組,細(xì)胞遷移能力與對照組相比增強(qiáng),然而在1000μg/ml處理組中,細(xì)胞遷移能力明顯受抑制(P<0.05)。
　　3.藥物處理12小時(shí)后,在1-100μg/ml組,細(xì)胞內(nèi)FoxM1紅色熒光的強(qiáng)度與對照相比明顯增強(qiáng),在0.1-100μg/ml組,HUVECs內(nèi) VEGF紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05)。
　　4.Western blot分析FoxM1和VEGF表達(dá)量的變化,研究發(fā)現(xiàn),藥物處理12和24小時(shí)后,在0

12、.1-100μg/ml處理組,FoxM1的表達(dá)均較對照組顯著提高;藥物處理12小時(shí),在10-100μg/ml處理組,VEGF中表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng),處理24小時(shí)后,與對照組相比,VEGF的表達(dá)在0.1-100μg/ml處理組中均增強(qiáng)(P<0.05)。
　　5.四種多聚物涂層支架(PLGA50,PLGA75,PDLLA和PLLA),涂層表面形態(tài)均一完整,較少出現(xiàn)多聚物聚集、橋接、開裂、剝脫等現(xiàn)象。4種涂層無明差異。
　　6.P

13、LGA50和PLGA75支架組與PDLLA和PLLA相比,釋放更為持續(xù)、良好。PLGA50和PLGA75釋放量高于PDLLA和PLLA組。
　　7.裸支架組和4種多聚物涂層支架組(PLGA50,PLGA75,PDLLA和PLLA),溶血率均<5%。四種多聚物涂層支架組PT和APTT與商品化金屬裸支架組無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　阿魏酸鈉促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,上調(diào)了FoxM1和VEGF的表達(dá),呈劑量依賴性。阿魏酸鈉