薯蕷皂苷元對Ad-TSHR-289誘導Graves病模型小鼠甲狀腺細胞增殖及免疫功能的影響.pdf

1、研究背景:
　　Graves病(Graves' disease，GD)是一種伴隨甲狀腺激素分泌增多的自身免疫性甲狀腺疾病，甲狀腺腫大、高代謝癥候群和Graves眼病是其典型的臨床特點。GD患者體內(nèi)免疫功能紊亂，存在異常增高的TSH受體抗體(TRAb)，TRAb是一組淋巴細胞分泌的多克隆抗體，可與TSH受體不同位點結(jié)合，當TRAb中興奮性抗體(TSAb)與甲狀腺細胞TSH受體結(jié)合時，激活腺苷酸環(huán)化酶信號系統(tǒng)，導致甲狀腺細胞過度增生和

2、甲狀腺激素合成分泌增加，從而引起甲狀腺腫大和甲狀腺功能亢進。
　　GD疾病過程中“甲狀腺細胞過度增生”與細胞增殖機制異常相關。近年來研究表明除了TRAb外，其它細胞增殖相關分子(IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA)在GD甲狀腺腫大過程中起著重要作用。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是一種在細胞生長和增殖中發(fā)揮重要作用的多肽。我們前期研究現(xiàn)IGF-1通過真核細胞轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通路，上調(diào)cyclin D1的

3、表達，促進大鼠甲狀腺細胞增殖。NF-κB是一種細胞轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，調(diào)控細胞增殖、細胞分化等過程。Cyclin D1是一種重要的細胞周期蛋白，調(diào)控細胞周期從期G1進入S期。增殖細胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，參與細胞周期S期DNA合成。
　　“免疫紊亂”是GD的誘發(fā)因素。近年來研究來表明GD患者存在T（淋巴）細胞亞群的異常，抑制性T細胞(Ts)功能缺陷，輔助性T細胞(Th)不適當致敏，使B（淋巴）

4、細胞產(chǎn)生TRAb。T細胞根據(jù)細胞膜表面CD分子劃分成不同的亞群。CD3分子僅存在于T細胞表面，因此主要用于標記成熟的T細胞。成熟的T細胞按照其表面CD分子的不同，又可分為CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞主要是Th; CD8+T細胞主要是Ts和細胞毒性T細胞(CTL):兩者的比值CD4+/CD8+反映體內(nèi)免疫功能狀態(tài)。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory Tcells，Treg)是體內(nèi)一類表型特征均為CD4+CD25+Foxp

5、3+T細胞，它能夠分泌IL-10和TGF-β，對T、B細胞具有抑制作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)T細胞在GD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　在過去的20年中，抗甲狀腺藥物（例如他巴唑、丙硫氧嘧啶、甲亢平）是非難治療性GD病最常見的治療方式，存在高復發(fā)率、治療周期長、對巨大甲狀腺腫療效不明顯的缺點。目前臨床上對GD發(fā)病過程中關鍵環(huán)節(jié)“甲狀腺細胞增殖”和“免疫紊亂”，缺乏針對性的藥物。
　　薯蕷皂苷元(Diosgenin，Dio)，是

6、一種天然來源的甾體皂苷元，以皂苷的形式主要存在于中藥穿龍薯蕷的根莖中。在過去的三十年中，Dio被用于治療或預防多種疾病，例如腫瘤、糖尿病、肥胖、血脂異常等。Moalic等報道Dio具有在體內(nèi)外抑制多種實體腫瘤及白血病細胞系生長的作用，這種抗腫瘤的機制涉及到對增殖、凋亡、脂代謝及COX/LOX通路等的調(diào)節(jié)。Dio是合成各種甾體類藥物的前體化合物，作為一種類固醇，其對免疫功能具有廣泛的作用，具有促進TNF-α分泌，抑制IgE產(chǎn)生，上調(diào)調(diào)節(jié)性

7、T細胞等作用。在傳統(tǒng)中醫(yī)民間驗方的應用中，穿龍薯蕷被用于甲狀腺瘤和甲狀腺功能亢進的治療。有中醫(yī)藥研究者報道穿龍薯蕷對免疫性大鼠甲狀腺腫大有治療作用。在前期的研究中我們報道了Dio能夠引起甲狀腺細胞細胞周期G0/G1的阻滯，降低cyclin D1表達從而抑制IGF-1誘發(fā)的人甲狀腺原代細胞增殖。上述研究發(fā)現(xiàn)，提示我們Dio可能是一種對GD有治療作用的藥物，特別是在抗增殖和調(diào)節(jié)免疫方面。
　　基于上述研究現(xiàn)狀，在本研究中，我們應用了一

8、個表達TSH受體A亞單位的重組腺病毒（Ad-TSHR-289）誘導的GD模型小鼠，該模型能非常有效地模擬人類GD病的發(fā)病過程。我們擬通過動物體內(nèi)實驗來研究Dio對GD的治療作用。
　　目的:
　　1.評價Dio對Ad-TSHR-289誘導GD模型小鼠甲狀腺腫大的治療作用;從抑制細胞增殖的角度，初步探討其分子生物機制。
　　2.研究Dio對Ad-TSHR-289誘導GD模型小鼠免疫功能的影響。
　　研究方法:

9、>　　1.動物模型構(gòu)建及藥物干預具體分組如下:正常對照組，正常小鼠高劑量Dio干預組（100 mg·kg-1·day-1），陰性病毒對照組，GD模型組，GD模型低劑量Dio治療組，GD模型高劑量Dio治療組。應用重組腺病毒Ad-TSHR-289，肌肉注射免疫雌性BALB/c小鼠，每隔3周注射一次，共3次，制備GD動物模型。成模后的小鼠分別給予高、低劑量的Dio治療。Dio治療12和24天后，分兩批次處死小鼠，留取血清、甲狀腺、脾臟標本。

10、
　　2.Dio治療過程中毒副作用的初步評估處死稱量前體重，采用全自動生化分析儀檢測血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)。
　　3.Dio對GD模型小鼠甲狀腺腫大治療作用評價采用放射免疫法和電化學發(fā)光法測TT4和TRAb變化;Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測量甲狀腺大小;H&E染色及電子顯微鏡觀察甲狀腺組織及超微結(jié)構(gòu)變化。
　　4.Dio抑制甲狀腺細胞增殖相關機制研究采用Br

11、dU摻入實驗檢測小鼠甲狀腺組織中增殖細胞的變化;免疫組化檢測Dio干預后小鼠甲狀腺組織中IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的變化;Real-time PCR檢測Dio干預后小鼠甲狀腺組織中IGF-1、cyclin D1、PCNA mRNA水平的變化。
　　5.Dio對免疫功能的影響流式細胞儀檢測Dio干預后小鼠脾細胞CD3、CD4、CD8、調(diào)節(jié)性T細胞的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Dio對正常

12、小鼠及GD模型小鼠的體重、AST、ALT、Cr均沒有顯著性影響。
　　2.TT4和TRAb的變化:與正常對照組相比，GD模型組出現(xiàn)明顯的TT4和TRAb增高(P＜0.05);與GD模型組相比，24天高、低劑量Dio治療能明顯降低GD模型小鼠血清中增高的TT4水平(P＜0.01)，這種降低存在劑量依賴性。24天的高、低劑量Dio治療并不能降低GD模型小鼠增高的TRAb水平。
　　3.甲狀腺大體照片觀察，12或24天的Dio治療

13、能明顯緩解GD模型小鼠的甲狀腺腫大。Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件進一步的測定甲狀腺截面積（代表甲狀腺大?。?。與正常組相比，GD模型組甲狀腺截面積明顯增大(P＜0.01);與GD模型組相比，高、低劑量Dio治療組甲狀腺面積均明顯縮?。≒＜0.05），這種作用存在劑量依賴性。
　　4.H&E染色發(fā)現(xiàn)，GD模型組甲狀腺增生明顯，濾泡上皮細胞成立方狀或高柱狀，排列緊密，增生向濾泡腔內(nèi)形成乳頭狀突起，濾泡形態(tài)不規(guī)則，濾泡內(nèi)

14、膠質(zhì)明顯減少。GD模型Dio治療組上述增生改變明顯緩解。
　　5.電子顯微鏡結(jié)果示，GD模型組甲狀腺細胞合成分泌功能活躍，電鏡下線粒體增多，體積增大，形狀不規(guī)則;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，池擴張，與線粒體相互纏繞;核膜凹陷，形狀不規(guī)則;胞質(zhì)內(nèi)見大量的內(nèi)吞膠質(zhì)滴。GD模型高劑量Dio治療組甲狀腺上述改變均得到緩解。
　　6.BrdU標記甲狀腺增殖細胞結(jié)果示:與正常對照組組相比，GD模型組甲狀腺內(nèi)的增殖細胞明顯增多（P＜0.01）。與GD

15、模型組相比，24天的高、低劑量Dio治療能明顯減少GD模型甲狀腺內(nèi)的增殖細胞(P＜0.05)。
　　7.免疫組化結(jié)果示:與正常對照組相比，GD模型組甲狀腺內(nèi)IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的表達增加(P＜0.05);與GD模型組相比，24天的高、低劑量Dio治療組甲狀腺內(nèi)IGF-1、NF-κB、cyclin D1、PCNA蛋白水平的表達降低(P＜0.05)，這種作用存在劑量依賴性。
　　8.Rea

16、l-time PCR結(jié)果示，與正常對照組相比，GD模型組甲狀腺內(nèi)IGF-1、cyclin D1、PCNA mRNA水平的表達增加(P＜0.01);與GD模型組相比，24天的高、低劑量Dio治療能明顯降低GD模型小鼠甲狀腺內(nèi)IGF-1、cyclin D1、PCNA mRNA水平的表達(P＜0.05)，這種作用存在劑量依賴性。
　　9.流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，Dio對小鼠脾細胞中淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8

17、+)無明顯影響作用。與正常對照組相比，GD模型組脾細胞中調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+T cells)百分率降低（P＜0.05）;與GD模型組相比，GD模型高劑量Dio治療組脾細胞中調(diào)節(jié)性T細胞百分率增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Dio具有緩解Ad-TSHR-289誘導GD模型小鼠甲狀腺腫大的治療作用;在治療過程中未發(fā)現(xiàn)Dio對體重、肝腎功有明顯的影響作用。
　　2.Dio緩解甲狀腺腫大的作