血管緊張素-(1-7)對人臍靜脈平滑肌細胞鈣化的影響及其可能機制.pdf

1、目的：
　　 本實驗在成功復制出人臍靜脈平滑肌細胞(human umbilical vein smooth muscle cells，HUSMCs)鈣化模型的基礎(chǔ)上，觀察血管緊張素-(1-7)[Angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]對HUSMCs鈣沉積的影響，探索Ang-(1-7)延緩或抑制HUSMCs鈣沉積的可能機制。
　　 方法：
　　 1.HUSMCs鈣化模型的復制
　　 采用不同

2、濃度β-甘油磷酸鹽（β-GP）刺激體外培養(yǎng)的HUSMCs，分為5組（n=6）：對照組（CON），終濃度為10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L的β-甘油磷酸鹽組（即10mmol/L組、12mmol/L組、14mmol/L組、16mmol/L組）。采用Von Kossa染色觀察HUSMCs鈣沉積情況，顯微圖像分析Von Kossa染色鈣化細胞百分比，磷酸苯二鈉法測定細胞中堿性磷酸酶（ALP）活性，甲基百里香

3、酚藍法測定各組細胞中鈣含量，探尋β-GP復制HUSMCs鈣化模型的最佳濃度。
　　 2.血管緊張素-（1-7）對HUSMCs鈣化的影響
　　 2.1.在成功復制HUSMCs鈣化模型基礎(chǔ)上，給予血管緊張素-（1-7）進行干預，分為6組（n=6）：對照組（CON）、鈣化組（CAL）、單純血管緊張素-（1-7）組[Ang-(1-7)組]、鈣化+血管緊張素-（1-7)高劑量組[Ang-(1-7) H組]、鈣化+血管緊張素-（1-

4、7)中劑量組[Ang-(1-7)M組]、鈣化+血管緊張素-（1-7)低劑量組[Ang-(1-7) L組]。
　　 2.2.檢測方法
　　 ①對細胞Von Kossa染色、顯微圖像分析、ALP活性和細胞鈣含量等指標進行檢測，觀察各組細胞鈣沉積情況。
　　 ②酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞培養(yǎng)液中TGFβ1活性。
　　 ③Western blot法檢測HUSMCs中核心結(jié)合因子1（core binding facto

5、r α1，Cbfα1）蛋白表達。
　　 ④放射免疫技術(shù)檢測培養(yǎng)液中骨鈣素（OC）含量，觀察HUSMCs骨鈣素變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.HUSMCs鈣化模型復制
　　 不同濃度β-GP誘導體外HUSMCs鈣化，Von Kossa染色結(jié)果顯示12mmol/L組大量HUSMCs呈菊花狀聚集生長，細胞聚集處可見棕褐色鈣結(jié)節(jié)，顯微圖像分析系統(tǒng)定量計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)12mmol/L組與CON組、10mmol/L組、1

6、4mmol/L組、16mmol/L組相比，鈣化細胞百分比明顯增加，細胞鈣含量和ALP活性均顯著升高，有顯著性差異。
　　 2.血管緊張素-（1-7）對HUSMCs鈣化影響
　　 ①Ang-(1-7)可明顯減少HUSMCs聚集生長，Von Kossa染色顯示細胞聚集處棕褐色鈣結(jié)節(jié)較CAL組明顯減輕（P<0.01)，Ang-(1-7)高、中、低劑量組鈣化細胞百分比、細胞鈣含量和ALP活性較CAL組明顯降低（均為P<0.01)

7、。
　　 ②Ang-(1-7)高、中、低劑量組與CAL組相比細胞TGFβ1水平、cbfα1表達、骨鈣素含量均降低（分別P<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1．12mmol/L β-GP刺激HUSMCs10天，可成功復制體外HUSMCs鈣沉積模型。
　　 2．采用顯微圖像分析系統(tǒng)可定量計算出Von Kossa染色鈣沉積情況，可作為鑒定Von Kossa染色鈣化的輔助方法。。
　　 3、Ang-(1