小尾寒羊腸道正常菌群高通量測(cè)序分析及羊源微生態(tài)制劑的研制.pdf

1、動(dòng)物的腸道菌群具有營(yíng)養(yǎng)與代謝，免疫與保護(hù)，維持腸道菌群平衡，改善腸道環(huán)境，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育等作用，動(dòng)物在一些應(yīng)激（冷、熱、驚嚇、長(zhǎng)途運(yùn)輸、細(xì)菌和病毒等）狀態(tài)下，腸道菌群會(huì)發(fā)生紊亂，繼而動(dòng)物發(fā)生腹瀉，免疫功能降低，生長(zhǎng)指標(biāo)下降等，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。小尾寒羊是我國(guó)優(yōu)質(zhì)的皮肉兼用型地方綿羊品種之一，因其具有軀體高大、性早熟、耐粗飼、生長(zhǎng)發(fā)育快、繁殖率高、抗病力強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定、適應(yīng)性廣等優(yōu)良特性，而被廣泛飼養(yǎng)。然而隨著飼養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大

2、，消化道類(lèi)疫病多發(fā)，特別是細(xì)菌性疾病。而且目前缺少良好的治療方法，盡管抗生素能治療消化道類(lèi)疫病，但會(huì)打破腸道菌群平衡狀態(tài)，造成腸道菌群紊亂以及細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。微生態(tài)制劑作為抗生素的輔助治療劑，有無(wú)殘留、無(wú)耐藥性、無(wú)毒副作用、效果顯著、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，其不但能防病治病、提高飼料轉(zhuǎn)化率和畜禽生產(chǎn)性能，還可以改善動(dòng)物健康狀況。但是目前缺少羊?qū)Ｓ玫奈⑸鷳B(tài)制劑，我們對(duì)羊腸道菌群的了解也不夠深入。目前對(duì)腸道菌群的研究多應(yīng)用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，

3、如實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和變性梯度凝膠電泳（DGGE），這些方法不僅耗時(shí)而且工作量大，且只能檢測(cè)出一定豐度以上的微生物，對(duì)復(fù)雜的腸道微生物群的研究不夠全面，而Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠測(cè)序到腸道中所有微生物DNA序列，全面分析腸道微生物群落的多樣性和豐度，以滿(mǎn)足我們對(duì)腸道微生物群落的認(rèn)識(shí)。因此，本試驗(yàn)采用Illumina MiSeq的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小尾寒羊腸道菌群的組成和多樣性進(jìn)行分析，并以分析的結(jié)果為依據(jù)，對(duì)小尾寒羊腸道細(xì)菌進(jìn)

4、行篩選，最后用篩選出的菌株研制成了微生態(tài)制劑，并對(duì)微生態(tài)制劑的效果進(jìn)行了檢驗(yàn)。
　　通過(guò)Illumina MiSeq的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小尾寒羊空腸、盲腸和直腸樣本中菌群組成、α多樣性、β多樣性和樣本聚類(lèi)等方面進(jìn)行了分析研究，結(jié)果顯示：在樣本菌群組成方面，小尾寒羊盲腸和直腸中主要細(xì)菌為Bacteroides（擬桿菌屬），Ruminococcus（瘤胃球菌屬），Lactobacillus（乳桿菌屬），Incertae_Sedis和Fl

5、avonifractor；空腸中主要細(xì)菌為L(zhǎng)actobacillus（乳桿菌屬），Chloroplast，Incertae_Sedis，Acetitomaculum和Ruminococcus（瘤胃球菌屬）；小尾寒羊空腸菌群組成與個(gè)體差異有關(guān)，而盲腸和直腸菌群組成相對(duì)來(lái)說(shuō)比較穩(wěn)定，與個(gè)體間的差異相關(guān)性不大。在樣本菌群變化趨勢(shì)方面，可以推測(cè)出，從小尾寒羊的十二指腸端到直腸端，乳桿菌屬的豐度越來(lái)越小，擬桿菌屬的豐度越來(lái)越大。在α多樣性分析方面

6、，小尾寒羊盲腸和直腸的細(xì)菌豐度和多樣性都大于空腸，而盲腸和直腸間的差異性不顯著。在β多樣性和樣本聚類(lèi)分析方面，小尾寒羊盲腸和直腸中細(xì)菌群落在進(jìn)化上的相似度較高，而前兩者與空腸中細(xì)菌群落相似度較低。
　　依據(jù)高通量測(cè)序的分析結(jié)果，采用傳統(tǒng)的生物學(xué)方法對(duì)小尾寒羊腸道中的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)分離的菌株進(jìn)行生長(zhǎng)性能、耐酸耐膽鹽和抑制有害菌生長(zhǎng)等方面的篩選，結(jié)果顯示：篩選出3株生長(zhǎng)速度快、對(duì)酸和膽鹽耐受力強(qiáng)、抑菌效果好的菌，分別為M1（干

7、酪乳桿菌）、M2（植物乳桿菌）和L1（枯草芽孢桿菌），將這3株菌發(fā)酵混合后制成微生態(tài)制劑，并通過(guò)飼喂小白鼠，檢驗(yàn)微生態(tài)制劑的安全性，結(jié)果表明：所研制的微生態(tài)制劑是安全的。
　　將研制的微生態(tài)制劑分別按低（3mL/只/d）、中（6mL/只/d）、高劑量組（12mL/只/d）混飲給予家兔，并對(duì)家兔生長(zhǎng)性能和免疫功能方面的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，研制的微生態(tài)制劑可以提高家兔平均日增重，降低料肉比，提高血清中兔瘟抗體水平、血清中IFN