TLR4、CD14在干燥綜合征發(fā)病中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、干燥綜合征(Sjogren’ssyndrome，SS)是一種主要累及外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫病。該病分為原發(fā)性干燥綜合征(PSS)和繼發(fā)性干燥綜合征(SSS)兩類，已成為嚴(yán)重危害人民健康的常見風(fēng)濕免疫病。SS的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明了，病因可能與遺傳、免疫、內(nèi)分泌和感染等因素有關(guān)。與其他自身免疫性疾病一樣，SS的正常免疫耐受機(jī)制被打破，產(chǎn)生對自身抗原的高滴度的自身抗體是其特點，能夠打破人體免疫耐受機(jī)制的因素很多，其中細(xì)菌感染與自身

2、免疫性疾病的關(guān)系，近年來受到廣泛重視。 TLR4(Tolllikereceptor，TLR4)、CD14是LPS應(yīng)答的主要受體，LPS可以通過Toll樣受體信號傳導(dǎo)系統(tǒng)介導(dǎo)固有免疫和自身免疫性疾病的發(fā)生，因此LPS-TLR4-CD14信號傳導(dǎo)通路成為研究自身免疫性疾病的新靶點。在臨床工作中觀察到，感染常常是SS發(fā)病和復(fù)發(fā)的誘因。本課題，旨在研究LPS-TLR4-CD14信號通路在SS發(fā)病中的作用，進(jìn)而闡述感染與SS發(fā)病的關(guān)系，為

3、今后SS的治療提供新思路。全文分四部分： 第一部分：LPS、IL-6、TNF-α在干燥綜合征患者血清中的分布及其相關(guān)性研究 目的：研究干燥綜合征患者血清中LPS的水平及其與細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、ESR的相關(guān)性。 方法：31例干燥綜合征患者按照病情分為初發(fā)組，緩解組和復(fù)發(fā)組，初發(fā)組根據(jù)血沉、CRP進(jìn)一步分為急性炎癥組和非急性炎癥組，采用鱟試劑法檢測LPS水平；ELISA法檢測IL-6、TNF-α;并進(jìn)行相關(guān)

4、性分析。 結(jié)果：①各組干燥綜合征患者IL-6、INF-α水平均高于健康對照組(P＜0.01)，初發(fā)組與緩解組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)初發(fā)組與復(fù)發(fā)組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；復(fù)發(fā)組LPS水平明顯高于初發(fā)組和緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其余各組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義。②LPS與相關(guān)因素進(jìn)行直線回歸分析顯示，PSS患者LPS與IL-6、INF-α、ESR水平呈正相關(guān)(P＜0.05)。⑧對初

5、發(fā)組患者進(jìn)一步分為急性炎癥組和非急性炎癥組，比較其各指標(biāo)水平，急性炎癥組和非急性炎癥組IL-6、TNF-α水平均高于對照組(P＜0.01)；急性炎癥組IL-6、TNF-α水平明顯高于非急性炎癥組(P＜0.01)；急性炎癥組LPS水平明顯高于非急性炎癥組(P＜0.01)；而非急性炎癥組LPS水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論：①.LPS參與了PSS的發(fā)病，感染是PSS患者發(fā)病和復(fù)發(fā)的原因之一；②.IL-6、T

6、NF-α參與了PSS的發(fā)病，且其血清中的水平隨著PSS病情變化而波動，可以作為臨床上觀察PSS病情活動指標(biāo)之一。 第二部分：干燥綜合征患者外周血淋巴細(xì)胞TLR4、CD14的表達(dá) 目的：探討干燥綜合征患者外周血淋巴細(xì)胞TLR4、CD14的表達(dá)。 方法：分別采用RT-PCR.法和流式細(xì)胞儀檢測了TLR4、CD14mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：干燥綜合征患者外周血單個核細(xì)胞TLR4、CD14mRNA和蛋白的表達(dá)

7、均高于對照組(P＜0.05)；初發(fā)組TLR4、CD14mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于緩解組表達(dá)水平(P＜0.05)；復(fù)發(fā)組TLR4、CD14mRNA和蛋白表達(dá)水平與緩解組表達(dá)水平相比明顯增高(P＜0.05)；病情復(fù)發(fā)組TLR4、CD14mRNA和蛋白表達(dá)水平與初發(fā)組TLR4、CD14mRNA和蛋白表達(dá)水平相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論：①PSS患者外周血淋巴細(xì)胞高表達(dá)TLR4和CD14，且與病情活動相一致；②LPS-T

8、LR4信號途徑參與了干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制。 第三部分：干燥綜合征患者唇腺組織TLR4、CD14的表達(dá) 目的：探討TLR4、CD14與干燥綜合征患者唇腺組織損傷的關(guān)系。 方法：采用免疫組化法檢測了干燥綜合征患者唇腺組織中TLR4、CD14的表達(dá)，同時采用RT-PCR法檢測唇腺組織中TLR4、CD14mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：①干燥綜合征組高表達(dá)TLR4和CD14，對照組TLR4、CD14均無表達(dá)；②病理分級為

9、0-1級者，TLR4、CD14的陽性率為62.5％，2級者陽性率為70％，3級者為75％，而4級的唇腺組織破壞嚴(yán)重，TLR4、CD14表達(dá)率反而下降為58.3％，各組間TLR4、CD14陽性率差別均具有顯著性；③在PSS的唇腺組織中，約64.4％的唇腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞有TLR4、CD14的表達(dá)，約67.8％的淋巴細(xì)胞灶中的淋巴細(xì)胞表達(dá)TLR4、CD14，唇腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中TLR4、CD14的表達(dá)與淋巴細(xì)胞灶中TLR4、CD14的表達(dá)差異無統(tǒng)

10、計學(xué)意義(P＞0.05)；④干燥綜合征組TLR4、CD14mRNA的表達(dá)高于對照組(P＜0.05)。 結(jié)論：①干燥綜合征唇腺組織高表達(dá)TLR4、CD14，TLR4、CD14信號通路可能是造成干燥綜合征唇腺組織損傷的原因之一；②導(dǎo)管上皮細(xì)胞在SS發(fā)病中是主動的參與者，而非被動的受害者，它與唇腺組織中浸潤的淋巴細(xì)胞一樣發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)。 第四部分：TLR4、CD14信號傳導(dǎo)通路在唇腺上皮細(xì)胞中的作用 目的：探討

11、TLR4、CD14信號傳導(dǎo)通路在唇腺上皮細(xì)胞中的作用。 方法：體外培養(yǎng)唇腺上皮細(xì)胞一周后，①分別于PSS組和對照組加入終濃度為1μg/ml的LPS，在FD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并于1h、8h、12h、24h、48h、72h提取細(xì)胞總RNA,RT-PCR法檢測TLR4、CD14mRNA表達(dá)，研究不同時相點LPS對唇腺上皮細(xì)胞的作用；②PSS組分別加入終濃度為1ng/ml、10ng/ml、102ng/ml、103ng/ml、104ng/

12、ml、105ng/mlLPS，對照組不加LPS，24小時后提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法檢測TLR4和CD14mRNA表達(dá)，研究不同濃度LPS對唇腺上皮細(xì)胞的作用；③根據(jù)步驟①、②得出的LPS刺激唇腺上皮細(xì)胞最有效濃度1μg/ml，最佳時間8h，繼續(xù)進(jìn)行實驗③的研究：取生長良好的PSS細(xì)胞分為三組：1)LPS組：加入終濃度為1μg/ml的LPS；2)阻斷組：先加入10μg/mlHTA125培養(yǎng)1小時，然后加入終濃度為μg/ml的LPS

13、繼續(xù)培養(yǎng)；3)對照組：不加LPS；37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法檢測NF-κBp65mRNA表達(dá)；提取細(xì)胞核蛋白，采用WesternBlot方法檢測NF-κBp65蛋白的表達(dá)；ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α、IL-6含量。 結(jié)果：①對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞角蛋白染色，證明所培養(yǎng)細(xì)胞來源于唇腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞；②LPS刺激后1h，TLR4和CD14mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，8h達(dá)到高峰

14、，此后持續(xù)升高至24h后逐漸下降；③1ng/ml濃度的LPS即可引起TLR4和CD14mRNA表達(dá)顯著增高，此后隨著LPS濃度的增高，表達(dá)繼續(xù)增強(qiáng)，當(dāng)LPS濃度達(dá)到10ng/ml以上時，繼續(xù)增加LPS濃度，TLR4和CD14mRNA表達(dá)雖仍有增多，但無顯著變化。④NF-κBp65mRNA和蛋白表達(dá)在LPS組、阻斷組和對照組變化一致，結(jié)果為：在阻斷組細(xì)胞表達(dá)最弱，與LPS組及對照組細(xì)胞相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01))；LPS組

15、細(xì)胞表達(dá)最高，與阻斷組、對照組相比較，其差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。⑤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6濃度在LPS組、阻斷組和對照組變化一致，結(jié)果為：在阻斷組細(xì)胞TNF-α、IL-6表達(dá)水平最低，與LPS組及對照組相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01))；LPS組表達(dá)最高，與阻斷組、對照組相比較，其差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01))。 結(jié)論：①唇腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞高表達(dá)TLR4和CD14mRNA，并且在LPS刺