MicroRNA-21在骨肉瘤生物學(xué)行為作用機(jī)制中的研究.pdf

1、第一部分
　　 背景與目的：骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡性骨腫瘤，易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，是骨肉瘤患者治療失敗的一個最主要的原因。探討miR-21在骨肉瘤和正常骨組織中的表達(dá)并分析其與臨床病理之間的聯(lián)系。
　　 方法：通過實時定量PCR方法檢測42例骨肉瘤組織(包括8例來自同一患者的原發(fā)骨肉瘤組織和轉(zhuǎn)移腫瘤組織)和來自同一患者的鄰近正常骨組織中miR-21的表達(dá)并根據(jù)臨床資料評估m(xù)iR-21的臨床相關(guān)性；利用Western blo

2、t和實時定量PCR方法檢測了8例原發(fā)腫瘤組織和周圍正常骨組織中RECK的表達(dá)，并分析其與miR-21表達(dá)的聯(lián)系。
　　 結(jié)果：miR-21在所有的組織中都有表達(dá)，且在腫瘤組織中比在正常骨組織中有明顯的高表達(dá)(P=0.013)，此外，miR-21在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中比在同一樣本中的原發(fā)腫瘤組織中高表達(dá)(P=0.002)。然而miR-21表達(dá)與性別，年齡，病變部位，腫瘤大小，分型和分期無關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)RECK在組織中均有表達(dá)，但是RE

3、CK 蛋白的表達(dá)在正常骨組織中比在對應(yīng)的腫瘤組織中高表達(dá)，而RECK mRNA表達(dá)在兩者中無明顯差異，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)RECK 蛋白的表達(dá)和miR-21表達(dá)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：在本研究中第一次發(fā)現(xiàn)相對于周圍相鄰的正常骨組織來說，miR-21在骨肉瘤組織中呈明顯過表達(dá)，說明miR-21 高表達(dá)可以作為骨肉瘤一個診斷指標(biāo)；且miR-21在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中比在原發(fā)腫瘤組織中高表達(dá)，預(yù)示miR-21 高表達(dá)潛在的導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移，

4、其可以作為骨肉瘤患者預(yù)后的一個指標(biāo)；RECK蛋白與miR-21表達(dá)的負(fù)相關(guān)也許意味著RECK是miR-21的一個調(diào)控靶點，miR-21 可通過調(diào)節(jié)RECK的表達(dá)而影響腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　 第二部分
　　 背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，其主要通過與靶mRNA 作用抑制轉(zhuǎn)錄后的翻譯。miR-21是唯一一個在9 種人類腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的小RNA分子。本研究旨在觀察anti-

5、miR-21 反義寡核苷酸(ASO)或是過表達(dá)質(zhì)粒對miR-21表達(dá)干擾后對骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖，凋亡，侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
　　 方法：構(gòu)建miR-21 ASO和miR-21 過表達(dá)真核表達(dá)質(zhì)粒并通過轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株MG-63，利用實時熒光定量RT-PCR檢測MG-63細(xì)胞中miR-21的表達(dá)變化，利用Western blot和實時定量PCR方法檢測了細(xì)胞中RECK的表達(dá)；并運用多種細(xì)胞增殖檢測方法觀察MG-63細(xì)胞增殖能力

6、；流式細(xì)胞術(shù)檢測MG-63細(xì)胞的凋亡率變化；Transwell細(xì)胞侵襲實驗觀察對MG-63細(xì)胞侵襲能力的影響；劃橫實驗檢測MG-63細(xì)胞遷移能力，并在體檢測miR-21 ASO 對骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 結(jié)果：經(jīng)證實成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒；實時熒光定量RT-PCR證實miR-21 ASO轉(zhuǎn)染組miR-21表達(dá)明顯減低，而miR-21 過表達(dá)真核表達(dá)質(zhì)粒組miR-21表達(dá)顯著上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)miR-21 ASO 轉(zhuǎn)染組MG-63

7、細(xì)胞增殖能力明顯低于對照；相反miR-21 過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)；miR-21ASO 轉(zhuǎn)染組MG-63細(xì)胞的凋亡較對照增加，相反miR-21 過表達(dá)組細(xì)胞凋亡減少；與對照相比，miR-21 ASO組穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，相反的現(xiàn)象出現(xiàn)在miR-21 過表達(dá)組；而且在調(diào)控miR-21的表達(dá)時，RECK 蛋白與miR-21的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)，此外報告基因載體證實miR-21 能直接作用于RECK3'-UTR。在體實驗

8、結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21 ASO 抑制腫瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤質(zhì)量較對照輕(P=0.013)，形成的體積較對照小。
　　 結(jié)論：上調(diào) miR-21表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞凋亡；而利用miR-21 ASO 抑制miR-21表達(dá)則能抑制進(jìn)細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；RECK 作為miR-21的一個靶點，miR-21 能影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為也許就是通過調(diào)節(jié)RECK的表達(dá)實現(xiàn)的；miR-21 作為骨肉瘤一個促癌基因，