雞糞中多重耐藥細(xì)菌的分離鑒定及介導(dǎo)抗性基因水平轉(zhuǎn)移元件的檢測(cè).pdf

1、由于抗生素在禽畜養(yǎng)殖、臨床醫(yī)藥等方面的大量使用，近年來(lái)出現(xiàn)了大量的多重耐藥細(xì)菌，但是，多重耐藥菌產(chǎn)生的機(jī)制并不完全清楚。研究表明，質(zhì)粒經(jīng)常攜帶一些可移動(dòng)的元件（如轉(zhuǎn)座子），捕捉不同的抗性基因介導(dǎo)抗生素抗性基因的擴(kuò)散，這被認(rèn)為是多重耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的主要機(jī)制之一。本論文圍繞質(zhì)粒在環(huán)境抗生素抗性基因水平傳播中所起的作用進(jìn)行以下幾方面的研究:
　　一、雞糞中多重耐藥細(xì)菌的分離鑒定及抗性檢測(cè)。用含有慶大霉素、氯霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、環(huán)丙沙

2、星、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素這八種抗生素的培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基)，我們從一規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)的雞糞中篩選出35株多重耐藥細(xì)菌。這些多重耐藥細(xì)菌分布在13個(gè)不同的屬，以革蘭氏陰性細(xì)菌為主導(dǎo)。在LB培養(yǎng)基中G-細(xì)菌與G+細(xì)菌分別占63％和37％，在SS培養(yǎng)基中G-細(xì)菌與G+細(xì)菌分別占87％和13％。這些細(xì)菌中對(duì)紅霉素具有耐藥性的最多，對(duì)阿莫西林具有耐藥性的最少，它們分布于變形菌門、放線菌門以及厚壁菌門?？股乜剐曰虺Ｅc重金屬抗性基因定

3、位在同一個(gè)遺傳元件上，我們將沒有抗生素抗性的大腸桿菌與2株耐8種抗生素細(xì)菌進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，這些多重耐藥菌對(duì)Zn、Pb、Cu、Mn的抗性比沒有抗生素抗性的細(xì)菌強(qiáng)。
　　二、多重耐藥細(xì)菌質(zhì)粒的檢測(cè)及遺傳特性研究。我們提取了各多抗菌的抗性質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入模式菌株DH5a中。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些多抗菌中均有一大小在15kb左右的質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入DH5a中。攜帶該質(zhì)粒的DH5a可以在加有四環(huán)素、卡那霉素、頭孢氨芐的LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這

4、表明該質(zhì)粒上可能攜帶這三種抗生素抗性基因。測(cè)序結(jié)果顯示，該質(zhì)粒大小為14591bp，將其與NCBI中現(xiàn)有質(zhì)粒進(jìn)行同源性對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其與一植物雙元穿梭表達(dá)載體pZGA22的相似度達(dá)到99％。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)其攜帶編碼四環(huán)素類（tetR_C、tetR_N）、磷酸轉(zhuǎn)移酶類(NTPⅡ、NTPⅢ)抗性基因以及一個(gè)能同時(shí)控制多種抗生素抗性和重金屬抗性的超家族域Glo_EDI_BRP。這些結(jié)果表明，該質(zhì)粒很可能具有介導(dǎo)環(huán)境中多種耐藥基因

5、（包括多種重金屬抗性基因）發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的能力。
　　三、質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移情況研究。首先，我們對(duì)不同多抗菌中15Kb大小質(zhì)粒進(jìn)行膠回收后酶切。酶切后的電泳圖譜顯示，這些質(zhì)粒很可能是同一個(gè)質(zhì)粒。接下來(lái)，我們根據(jù)該質(zhì)粒的全序列設(shè)計(jì)12對(duì)引物，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序與拼接。結(jié)果顯示，存在于干燥棒狀桿菌Corynebacterium xerosis、河流漫游球菌Vagococcus fluvialis、大腸桿菌Escherichia coli