粘細菌分離方法探究.pdf

1、目前環(huán)境中超過99％的微生物仍然是不可培養(yǎng)的，這表明微生物資源潛力巨大。宏基因組測序技術的發(fā)展為我們提供了不依賴培養(yǎng)即可了解環(huán)境微生物的方法，但是基于培養(yǎng)的對微生物性狀以及生理生化特性的研究，仍然是傳統(tǒng)微生物分類依據(jù)，也是將豐富微生物資源運用到生產(chǎn)實踐中必不可少的方法。
　　本文分析了目前關于新型微生物的分離方法，發(fā)現(xiàn)特定的分離方法只對環(huán)境中的特定微生物類群有效，換句話說，定向分離特定環(huán)境微生物要根據(jù)其特性設計針對性實驗。就粘細菌

2、而言，除了具有分布廣、豐都高、代時長等特點外，還具有顯著的社會性，如生長的細胞密度依賴，群體運動，群體捕食等。鑒于粘細菌的這些特點，本文設計了微球包埋結(jié)合粘細菌助長的體系，嘗試對環(huán)境中未知粘細菌進行分離篩選。
　　在本文的工作中，我們建立了低熔點瓊脂糖微球包埋的制備方法，得到直徑在50-70μm間的微球，并在微球中包埋單個細胞，包埋比例約為1∶10。然后我們將制得的含有單細胞微球接種于由粘細菌作為助長菌的助長體系中，通過粘細菌間的

3、相互促進作用，使球內(nèi)的單細胞分裂為微菌落，再通過顯微操作技術，直接選取成功獲得微菌落的微球，進行后續(xù)測序及培養(yǎng)。在進行粘細菌間的包埋助長實驗時，我們發(fā)現(xiàn)粘細菌間的確存在生長的相互促進作用，即被包埋的單個細胞在助長粘細菌的存在下可以分裂為菌落。這種促進作用在親緣關系較近的粘細菌種群之間均可發(fā)生，且不依賴于接觸。在進行土壤樣品的包埋助長實驗時，我們獲得了約100株球內(nèi)微菌落，但測序結(jié)果沒有檢測到粘細菌，推測由于土壤環(huán)境存在許多快速生長菌，導

4、致生長緩慢的粘細菌在復雜環(huán)境中難以被發(fā)現(xiàn)。
　　為了定向富集環(huán)境中的粘細菌，本文采用較為先進的拉曼技術嘗試對環(huán)境中疑似粘細菌的桿狀細胞進行富集后，在運用到包埋助長實驗中。我們首先得到了6屬13株不同粘細菌的拉曼光譜，通過與其它類群微生物比較，發(fā)現(xiàn)于1150cm-1及1503cm-1處存在粘細菌特有的條帶，可以作為定向拉曼彈射環(huán)境疑似粘細菌的依據(jù)。我們共對約150個環(huán)境桿狀細胞進行拉曼測試，得到10個含有1或2個特殊條帶的細胞，經(jīng)過