HSV-2的培養(yǎng)及gG-2基因特異片段的原核表達(dá).pdf

1、Ⅱ型單純皰疹病毒HSV-2 是最常見的性傳播疾病的病原體之一，可引起生殖器皰疹、新生兒皰疹等，還可顯著增加其它性傳播疾病如HIV的傳播率及獲得率，目前尚沒有有效的疫苗可用于臨床，因此，對(duì)于HSV-2 感染的早期診斷就顯得尤為重要。目前，國外已經(jīng)有三種試劑盒取得美國食品與藥物管理局批準(zhǔn)；
　　 在國內(nèi)，尚未見有效的試劑盒用于臨床，基本上依賴于進(jìn)口，很難適合于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的開展，對(duì)此研究也非常有限。
　　 為此，本研究

2、選取了HSV-2的型特異性抗原即包膜糖蛋白gG-2 為研究對(duì)象，從HSV-2 感染宿主Hela 細(xì)胞獲得大量病毒液入手，獲取HSV-2基因組，接著從中調(diào)出gG-2基因，全長2 097bp，再根據(jù)gG-2的氨基酸、核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異序列引物，克隆其抗原性較高、保守性較強(qiáng)的第343-523位特異肽段編碼基因，測(cè)序證實(shí)為所需目的基因后，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T/gG-2，然后采用PCR、雙酶切方法篩選證實(shí)已插入目的

3、基因片段的重組陽性克隆，用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)出重組融合蛋白GST/gG-2，SDS-PAGE 分析得出最佳誘導(dǎo)劑濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間分別為1mmol/L和3.5h，采用16 ℃的低溫誘導(dǎo)可以使GST/gG-2 以可溶性形式表達(dá)，相對(duì)分子量約為46 000，進(jìn)一步運(yùn)用谷胱甘肽瓊脂糖珠對(duì)其進(jìn)行親和純化。研究結(jié)果表明，對(duì)于遺傳特性相對(duì)穩(wěn)定的基因來說，通過病毒感染培養(yǎng)細(xì)胞是可行的。對(duì)于基因組DNA的提取，傳統(tǒng)的酚氯仿法依然是最佳的選擇。在克隆gG