蛹蟲草纖溶酶的分離純化、酶學性質及溶栓抗栓作用研究.pdf

1、血栓性疾病包括急性心肌梗死，缺血性心臟病，心血管疾病，心臟瓣膜病，周邊血管疾病，心律失常，高血壓等，日漸威脅著人類的健康。世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，心血管疾病已經占全世界死亡率的29％。鑒于此，溶栓抗栓藥物的研制開發(fā)已成為國內外研究熱點之一。目前用于血栓性疾病治療的藥物都不同程度具有纖維蛋白特異性差、體內半袁期短、生產成本高、需大劑量連續(xù)周藥等缺點。于是，國內外專家學者，逐漸將目光投向尋找一些安全性好、副作用小、療

2、效好的天然來源的溶栓藥物。 蟲草菌是我國傳統(tǒng)名貴中藥，屬子囊菌門(Ascomycota)、子囊菌綱(Ascomycetes)、糞殼菌亞綱(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草菌屬(Cordyceps(Frey)Link)，是一種蟲生真菌；在民間，常常被稱為冬蟲夏草。藥理學研究表明在增強免疫力，抗腫瘤，抗細菌和抗真菌等方面具有良好功效；蛹蟲草因與

3、冬蟲夏草有著相似的結構和功能，近年來備受各界關注。迄今為止，蛹蟲草是否具有纖溶功能還未見報道。 本研究首次篩選到一株產生高活性纖溶酶的SN-18菌株，進行了形態(tài)和分子鑒定；優(yōu)化了培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成，進而對蛹蟲草纖溶酶進行分離純化，研究了酶學性質以及體內和體外的溶栓抗栓功能，為進一步研究與應用開發(fā)提供了必要的工作基礎和科學依據(jù)。主要研究結果如下： 一、纖溶活性菌株SN-18的分離鑒定及產纖溶酶發(fā)酵特性研究 1.根

4、據(jù)菌絲形態(tài)，分生孢子形態(tài)以及人工培養(yǎng)產生的子座形態(tài)對分離篩選到的具有最強的纖溶活性編號為SN-18菌株進行鑒定，初步推測為蛹蟲草. 2.對基因組DNA的ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域的PCR產物測序，將測序結果運用Blastn程序與GenBank中的核酸序列進行比對分析，篩選與SN-18同源性較高的典型菌株構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。根據(jù)序列相似性分析結果得知：菌株SN-18與蛹蟲草C.miitarisAY899258和蛹蟲草擬青霉P

5、aecilomgcesmilitarisDQ342250、DQ342248具有相當高的同源性，相似性達100％，結合形態(tài)鑒定的結果可以判斷SN-18就是蛹蟲草。 3.采用單因素試驗法確定了SN-18產纖溶酶的最佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基組成為面粉1％，蠶蛹粉5％，接種量10％；培養(yǎng)條件為轉速160r/m，裝液量30mL/250mL，溫度25℃，培養(yǎng)時間為6天。發(fā)酵液纖溶酶活力達到32.34U/ml，是未優(yōu)化前的PDA液體培養(yǎng)

6、基的2.31倍。 二、蛹蟲草纖溶酶的分離純化和酶學性質 1.蛹蟲草液體發(fā)酵液離心，獲得粗酶液，粗酶液經硫酸銨分級沉淀后，收集活性成份，經凝膠層析達到電泳純。 2.酶活最適pH和最適溫度為pH6.0和25℃。Mg2+和Fe2+促進酶活，EDTA和Cu2+抑制酶活。經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，得出單一條帶，其近似分子量為27.3kDa。N端氨基酸序列為IVGGVSVAIE(Swissprot登錄號P85318)

7、 三、蛹蟲草纖溶酶溶栓、抗栓作用研究 1.溶栓作用實驗表明： 蛹蟲草纖溶酶具有直接降解纖維蛋白的纖溶活性。 體外對毛細管血凝塊溶解實驗結果為：毛細管血凝塊于37℃培養(yǎng)3h后，蛹蟲草纖溶酶(12U/ml)組的溶解率為29.49％，與生理鹽水空白對照組(3.01％)差異顯著(P<0.01).注入蛹蟲草纖溶酶的毛細管由于其中的血凝塊被溶解而使管內的溶液變紅，血凝塊明顯變短變細，而且在管內隨液體滑動，阻塞消除.而空白

8、對照則保持阻塞狀態(tài). 體外對血凝塊溶解實驗結果為：蛹蟲草纖溶酶分別取24U/ml、24U/ml、12U/ml、6U/ml四個濃度，以尿激酶12U/ml為陽性對照和生理鹽水為空白對照，各取8ml，在37℃，90r/min條件下，12小時之內，考察對0.5g的血凝塊的溶解率。結果為24U/ml、12U/ml、6U/ml三個濃度對血凝塊的溶解率分別為99％、53.4％、14.2％、8.6％和4.4％，且三個濃度組呈量效關系。24U/m

9、l濃度組在12h后，試管中完全看不到血凝塊，其溶解后的微粒懸浮在試管中，使試管內液體由澄清變混濁。而尿激酶12U/ml陽性對照組，還可以看到成型的血凝塊，溶液的顏色和做為空白的生理鹽水組相近，還較澄清。 2.抗栓作用實驗表明： 蛹蟲草纖溶酶粗制液在體內8min之內就對大鼠血小板性動脈血栓形成具有明顯的抑制作用，蛹蟲草纖溶酶中劑量組(ivCMase12U/kg)在體內對大鼠血小板性動脈血栓形成的抑制作用與尿激酶(iv250

10、U/kg)相當，二者差異不顯著；中(ivCMase12U/kg)，高劑量(ivCMase18U/kg)給藥組與空白對照組有顯著差異(P<0.01)，并且三個給藥組呈量效關系。 蛹蟲草纖溶酶粗制液在體內8min之內就對ADP誘導的大鼠血小板聚集具有明顯的抑制作用，蛹蟲草纖溶酶中劑量組(ivCMase12U/kg)對ADP誘導的大鼠血小板聚集的抑制作用與尿激酶(iv500U/kg)相當，二者差異不顯著，中(ivCMase12U/kg