局部亞低溫對大鼠全腦缺血-再灌注損傷的影響.pdf

1、目的：探討局部亞低溫對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的保護作用及其作用機制。 方法 1、實驗分組及動物模型的制備32只SD雄性大鼠，體重200～250 g(河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。隨機分為4組，每組8只。假手術組(S組)：分離并暴露雙側頸總動脈，開顱并暴露基底動脈第二無血管區(qū)，僅穿線不阻斷；缺血/再灌注組(I/R組)：采用3血管(雙側頸總動脈和基底動脈)阻斷法建立全腦缺血/再灌注損傷模型，缺血10 min，再灌注6 h

2、；亞低溫組(H組)：再灌注前即刻經(jīng)股靜脈緩慢注射10℃生理鹽水3.5 ml，結合頭部冰塊降溫，60 W白熾燈照射身體，監(jiān)測鼓膜溫度和直腸溫度。再灌注前體溫維持正常，再灌注后1 min內(nèi)鼓膜溫度降至并維持在32～34℃，直腸溫度同時降低，20 min左右升至并維持在37.5～38.7℃，低溫維持3 h，3 h后60 W白熾燈照射身體緩慢復溫；5-羥葵酸鹽+亞低溫組(5-HD+H組)：缺血前30 min腹腔內(nèi)注射1 mg/ml線粒體ATP敏

3、感性鉀通道抑制劑5-羥葵酸(5-HD)10 mg/kg，其它3組腹腔內(nèi)注射等容積生理鹽水。腦缺血前5 min、腦缺血10 min、再灌注后10 min采集股動脈血檢測動脈血氧分壓和動脈血二氧化碳分壓。 2、標本的采集及檢測方法 2．1大鼠血清S100B蛋白濃度的檢測于再灌注6 h，水合氯醛腹腔注射再次麻醉大鼠，采集頸內(nèi)靜脈血樣2 ml，于37.5℃恒溫水箱中水浴30 min后，以半徑8 cm、以轉速3500 r/min

4、離心10 min，取血清，置于液氮罐中保存?zhèn)溆?。嚴格按照大鼠血清S100B蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的要求測定出各種濃度的標準品的吸光度，并繪制標準曲線、求得回歸方程。采用ELISA法檢測出血清S100B蛋白的吸光度，根據(jù)回歸方程求得S100B蛋白濃度。 2．2大鼠腦水含量的測定斷頭法處死大鼠，完整取出腦組織，去除中腦及腦橋，留取左側大腦組織，用濾紙吸干表面水份后置于干燥小瓶中，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。用?110℃24h烘干)、

5、濕重法計算腦水含量，作為腦水腫程度的判斷。計算方法：腦水含量(％)=(濕重一干重)/濕重×100％。 2．3大鼠腦組織勻漿MDA含量和SOD活性的測定取右側腦組織，-20℃冰箱保存。用PBS緩沖液制備10％腦組織勻漿，嚴格按照試劑盒說明書的要求采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法測定腦組織勻漿MDA含量和SOD活性。 2．4光鏡觀察皮質神經(jīng)元的病理學改變在冰盤上取右側大腦額葉同一部位，切取厚度為3mm，面積5mm×5mm組

6、織塊，冷鹽水沖洗干凈后置于4％多聚甲醛中搖勻，室溫下過夜，在10×40光鏡下觀察皮質神經(jīng)元的病理學改變。 2．5透射電鏡下觀察皮質神經(jīng)元線粒體的超微結構右側大腦半球額葉同一部位按照“快、小、輕、準”四字原則在冰盤上切取1mm×1mm×1mm的組織塊。于4％戊二醛固定液中，4℃冰箱中保存。固定1h以上后送電鏡實驗室，在透射電鏡下觀察皮質神經(jīng)元線粒體的超微結構。結果1各組間體重、腦缺血前5 min、腦缺血10 min、再灌注后10

7、min血氣指標比較差異無統(tǒng)計學意義。 2、各組間腦組織勻漿SOD活性的比較S組SOD活性為68±10 U/mg prot；I/R組為29±6 U/mgprot；H組為51±6U/mg prot；5-HD+H組為44±4U/mgprot。 與S組比較，I/R組SOD活性降低(P<0.05)；與I/R組比較，H組SOD活性升高(P<0.05)； 5-HD+H組SOD活性與H組比較降低，與I/R組比較升高(P<0.05)。

8、3各組間血清S100B蛋白濃度、組織含水量及腦組織勻漿MDA含量的比較S組血清SIOOB蛋白濃度為0.01±0.00μg/L，組織含水量為(78.4±1.2)％，MDA含量為1.98±0.11nmol/mgprot；I/R組血清SIOOB蛋白濃度為0.86±0/35μg/L，組織含水量為(85.8±1.4)％，MDA含量為4.0±0.14nmol/mgprot；H組血清SIOOB蛋白濃度為0.42±0.07μg/L，組織含水量為(80.

9、1±1.6)％，MDA含量為2.51±0.24nmol/mgprot；5-HD+H組血清S100B蛋白濃度為0.64±0.06μg/L，組織含水量為(82.2±1.7)％，MDA含量為3.37±0.18 nmol/mgprot。 與S組比較，I/R組SIOOB蛋白濃度、組織含水量、MDA含量升高(P<0.05)；與I/R組比較，H組S100B蛋白濃度、組織含水量、MDA含量降低(P<0.05)； 5-HD+H組S100B蛋白濃

10、度、組織含水量、MDA含量與H組比較升高，與I/R組比較降低(P<0.05)。 4光學顯微鏡觀察皮質神經(jīng)元的病理學改變光鏡觀察到：S組神經(jīng)細胞形態(tài)結構正常，胞漿豐富、均勻淡染，核圓形或橢圓形，核仁明顯：H組大部分神經(jīng)細胞輕度皺縮、結構基本正常，核橢圓形，核仁清楚，其間有少許嗜伊紅神經(jīng)細胞，細胞周圍輕度水腫：5-HD+H組損傷范圍擴展，大量神經(jīng)細胞固縮，嗜伊紅性，尼氏體分解，核漿分界不清，核仁不清，細胞周圍中度水腫，見于大腦皮質全層：I/

11、R組損傷范圍進一步擴展，神經(jīng)細胞嚴重固縮深染，尼氏體消失，核漿溶合，細胞周圍高度水腫。 電鏡觀察到：S組神經(jīng)細胞形態(tài)結構正常，線粒體少部分嵴融合或消失；I/R組細胞質明顯水腫，線粒體大部分或全部嵴、部分或大部分膜融合或消失；H組細胞質有輕度水腫，線粒體部分嵴和膜融合或消失；5-HD+H組細胞質水腫，核膜水腫，線粒體部分和大部分嵴和膜融合或消失。 總的來看：S組損傷最輕，I/R組損傷最重，H組和5-HD+H組損傷程度介于