肝細(xì)胞特異性丁型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的初步研究.pdf

1、丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus,HDV)是迄今首先發(fā)現(xiàn)的具有共價(jià)閉合環(huán)狀負(fù)鏈RNA基因組的動(dòng)物病毒。其毒粒直徑35～37nm,為大小介于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的Dane顆粒和其表面抗原HBsAg顆粒之間的球形顆粒。病毒顆粒外層由脂雙層和HBsAg組成,內(nèi)含由HDAg和HDV RNA基因組結(jié)合組成的核蛋白體。嗜肝性病毒的表面蛋白對(duì)HDV病毒侵入和新HDV病毒顆粒的裝配必不可少。

2、
　　 基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體能將基因或其它核酸物質(zhì)運(yùn)載到細(xì)胞中,載體系統(tǒng)在生物技術(shù)中具有不可或缺的作用。根據(jù)載體的組成和制備過程可將基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體是將外源基因包裝到天然病毒的外殼中,利用病毒對(duì)宿主細(xì)胞的感染將外源基因?qū)爰?xì)胞中。目前常用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和單純皰疹病毒載體等。用于基因治療的病毒載體的靶向性可以通過包膜蛋白上的靶向性結(jié)合分子和組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)控作

3、用來實(shí)現(xiàn)。
　　 HDV是一種特異性感染人及靈長(zhǎng)類動(dòng)物肝細(xì)胞的病毒,其生活周期需要HBV為其裝配成感染性病毒顆粒提供包膜蛋白;HBV大表面抗原L-HBsAg中PreS的延長(zhǎng)部分包含有肝細(xì)胞特異性結(jié)合位點(diǎn),故HDV和HBV都具有肝細(xì)胞的親嗜性。但是,HDV RNA的復(fù)制是在宿主細(xì)胞內(nèi)RNA聚合酶的催化下完成的,該過程并不需要HBV的存在。鑒于以上特性,HDV可以改造成一種靶向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)生物活性RNAs的特異性載體。有研究者采用57

4、nt的非HDV序列取代了棒狀結(jié)構(gòu)一端的13nt的HDV序列,結(jié)果改造后的病毒的復(fù)制效率為20％,證明了改造后的病毒可以作為轉(zhuǎn)運(yùn)生物活性小RNA的載體工具。但是,將HDV改造成一種基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體工具還需大量的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 目的:
　　 篩選能夠穩(wěn)定表達(dá)L-HBsAg和S-HBsAg的細(xì)胞系,為HDV的體外裝配提供包膜系統(tǒng);構(gòu)建含HDV cDNA多聚體的真核表達(dá)載體,體外研究HDV基因組的復(fù)制及裝配,為肝細(xì)胞特異性丁型肝炎

5、病毒載體的構(gòu)建提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.包膜蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建:以pGEMT-HBV為模板,PCR擴(kuò)增編碼S-HBsAg和L-HBsAg的基因片段,然后連接到pGEM-T載體上,得到重組載體pGEMT-S和pGEMT-LS。利用ApaⅠ和NotⅠ分別酶切pGEMT-LS與pcDNA3.1(-)、pGEMT-S與pBSK,目的片段回收后利用T4連接酶連接后得到pcDNA3.1-LS和pBSK-S。利

6、用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切pBSK-S和pcDNA4/His MaxA,目的片段回收后利用T4連接酶連接得到重組載體pcDNA4-S,最后分別采用質(zhì)粒PCR和酶切驗(yàn)證重組載體的正確性。
　　 2.穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將pcDNA3.1-LS轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞,48小時(shí)后利用G418進(jìn)行壓力篩選,陽性克隆經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后以單細(xì)胞的形式移至96孔板內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng),篩選得到的穩(wěn)定細(xì)胞系經(jīng)RT-PCR和SDS-PAGE檢測(cè);p

7、cDNA4-S質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入經(jīng)鑒定后穩(wěn)定表達(dá)有L-HBsAg的HepG2細(xì)胞,采用Zeocin進(jìn)行壓力篩選預(yù)期得到能夠同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)L-HBsAg和S-HBsAg的穩(wěn)定HepG2細(xì)胞系。
　　 3.重組HDV真核表達(dá)載體的構(gòu)建:通過HindⅢ和BamHⅠ雙酶切位點(diǎn),pcDNA3.1-D2載體中的HDV二聯(lián)體的連接入pUC19克隆載體從而得到pUC19-D2;采用HindⅢSacⅠ雙酶切位點(diǎn),pUC19-D2中的HDV二聯(lián)體分

8、別重組入pEGFP-N1和pEGFP-C1載體,得到含有EGFP標(biāo)簽的重組載體pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2。
　　 4.HDV體外復(fù)制研究:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將重組HDV真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,通過熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別提取RNA和蛋白進(jìn)行熒光定量PCR和EUSA檢測(cè)丁型肝炎病毒基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定重組

9、載體,pcDNA3.1-LS和pcDNA4-S重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功:
　　 2.pcDNA3.1-LS轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,利用900μg/ml的G418篩選14天后獲得了陽性細(xì)胞克隆,經(jīng)PCR以及SDS-PAGE鑒定的HepG2細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)有L-HBsAg。在此基礎(chǔ)上,利用800μg/ml的Zeocin篩選同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)L-HBsAg和S-HBsAg的細(xì)胞系未獲成功;
　　 3.經(jīng)PCR和酶切鑒定重組載體,證明成功構(gòu)

10、建了同時(shí)表達(dá)有HDV二聯(lián)體以及EGFP標(biāo)簽的pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2重組載體;
　　 4.攜帶EGFP標(biāo)簽的重組HDV載體在293T細(xì)胞中能夠表達(dá)EGFP,但強(qiáng)度較pEGFP-N1對(duì)照組要弱;pEGFP-N1-D2和pEGFP-C1-D2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后能夠在體外起始HDV基因組的復(fù)制。經(jīng)熒光定量PCR分析目的基因的表達(dá)量為105copies/μl,其水平與pSVL-D3和pcDNA3.1-D2相當(dāng);但是

11、對(duì)HDAg的ELISA分析顯示細(xì)胞內(nèi)HDAg的表達(dá)量較低。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法獲得了穩(wěn)定表達(dá)有HBV L-HBsAg的HepG2細(xì)胞系,但是同時(shí)利用兩種抗生素進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選還需進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案來驗(yàn)證。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了含有EGFP的重組HDV真核表達(dá)載體,并利用脂質(zhì)體法將重組載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,通過觀察綠色熒光、熒光定量PCR和ELISA檢測(cè)等方法分析證實(shí)了重