雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中TNF-α通過MiR-21影響小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的研究.pdf

1、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是絕經(jīng)后婦女的高發(fā)病癥，系代謝性骨病變，表現(xiàn)為單位體積內(nèi)骨組織量減少，其特點(diǎn)為骨形成與骨吸收平衡紊亂。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病過程的早期，破骨活動加強(qiáng)，成骨也隨之代償性加強(qiáng)，但隨著病程的進(jìn)展，由于雌激素（estrogen，E2）缺乏引起一些炎癥因子，例如白介素1(IL-1）、白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ（IFN-γ）水平升高，使

2、成骨活動受到抑制，從而導(dǎo)致成骨破骨的平衡被打破，引起骨量喪失。目前對PMOP發(fā)病過程中炎癥因子，尤其是TNF-α促進(jìn)破骨的研究很多，其機(jī)制也逐漸被闡明，而關(guān)于TNF-α抑制成骨的機(jī)制并不明確。
　　骨形成主要為成骨細(xì)胞的成熟礦化，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stromal cells，mBMSCs）是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞。BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力，將直接影響到機(jī)體的骨形成。近年來一些研究表明PMOP發(fā)病過程中m

3、BMSCs的成骨功能受損，但是參與其中的分子機(jī)制目前尚不清楚。
　　MicroRNA（miRNA）是一種非編碼小分子RNA，長度為19～25個核苷酸序列，具有高度的組織特異性和序列保守性。近年大量研究已經(jīng)表明，一些miRNA在干細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)進(jìn)程以及一些腫瘤及炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。其作用機(jī)制是它們識別于特定的靶mRNA，并與后者3’非翻譯區(qū)相結(jié)合，于轉(zhuǎn)錄后負(fù)向調(diào)控后者表達(dá)。PMOP的環(huán)境是一種炎癥微環(huán)

4、境，那么在這種的微環(huán)境中，miRNA的調(diào)控作用是否會受到影響？以及會受到怎樣的影響？受到影響的miRNA調(diào)控作用是否會導(dǎo)致到干細(xì)胞的成骨分化受到影響？其分子機(jī)制又是如何？為了回答這些問題，本研究通過建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松C57小鼠模型，對其與假手術(shù)組（Sham）的mBMSCs進(jìn)行miRNA芯片掃描，并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出關(guān)鍵microRNA（miR-21）。研究miR-21在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松微環(huán)境中對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

5、的調(diào)控作用，將有助于進(jìn)一步加深對PMOP的致病機(jī)理的了解，為PMOP的治療提供新的思路和方法。
　　研究目的
　　（1）尋找雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境下調(diào)控mBMSCs成骨的關(guān)鍵miRNA（miR-21）。
　?。?）探討在miR-21在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松微環(huán)境下是否參與調(diào)控mBMSCs成骨及其在此種微環(huán)境下對成骨的調(diào)控作用。
　?。?）探討在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中炎癥因子對miR-21的調(diào)

6、控，以及對mBMSCs成骨影響的分子機(jī)制。
　　研究方法
　?。?）建立去勢（OVX）動物模型，通過microCT、組織學(xué)方法以及real time RT-PCR、western blot、茜素紅和ALP染色等技術(shù)觀察OVX小鼠BMSCs（mBMSCs）的成骨能力，Elisa方法檢測OVX小鼠體內(nèi)E2，各種炎癥因子的水平。
　　（2）通過生物信息學(xué)技術(shù)以及microRNA基因芯片技術(shù)對OVX組和Sham組的C57BL/

7、6J小鼠來源的mBMSCs進(jìn)行對比篩選，確定調(diào)控mBMSCs成骨的關(guān)鍵miRNA（miR-21）。利用real time RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證miR-21在OVX及Sham組mBMSCs成骨分化過程中的表達(dá)差異。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)和下調(diào)miR-21，real time RT-PCR、western blot、茜素紅和ALP染色等技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染后mBMSCs的成骨能力。
　?。?）在成骨誘導(dǎo)的過程中，分別用IFN-γ（0.1ng/m

8、L）、IL-1β(1ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)刺激正常C57小鼠來源的mBMSCs，real time RT-PCR技術(shù)檢測miR-21的表達(dá)。對照芯片結(jié)果，篩選出主要影響miR-21的炎癥因子（TNF-α）。在TNF-α刺激下，過表達(dá)miR-21，real time RT-PCR和western blot技術(shù)分別檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　?。?）通過分別注射E2和TNF-α中和抗體至OVX后C57小鼠體內(nèi)，

9、檢測其體內(nèi)TNF-α水平及miR-21的表達(dá)，體內(nèi)驗(yàn)證miR-21雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中的成骨分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立小鼠 OVX模型，OVX組骨密度明顯低于 Sham組，OVX組mBMSCs的成骨能力低于Sham組，OVX小鼠體內(nèi)E2水平降低，各種炎癥因子的水平升高。
　　2、通過生物信息學(xué)技術(shù)以及microRNA基因芯片技術(shù)篩選，確定調(diào)控mBMSCs成骨的關(guān)鍵miRNA：miR-21。re

10、al time RT-PCR顯示miR-21在OVX組mBMSCs成骨分化中的水平較Sham組低。轉(zhuǎn)染miR-21至OVX組mBMSCs，能部分恢復(fù)其成骨分化能力。
　　3、篩選出主要影響miR-21的炎癥因子：TNF-α。在TNF-α刺激下，mBMSCs成骨能力降低，miR-21表達(dá)水平降低。轉(zhuǎn)染miR-21至TNF-α刺激下的mBMSCs，real time RT-PCR、western blot、茜素紅和ALP染色等技術(shù)提示

11、miR-21能部分恢復(fù)其成骨分化能力。
　　4、注射E2和TNF-α中和抗體至OVX小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示OVX組小鼠體內(nèi)TNF-α水平回落，miR-21水平回升，股骨骨密度增高。
　　結(jié)論：
　　1、miR-21是雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中調(diào)控mBMSCs成骨分化的關(guān)鍵miRNA。
　　2、miR-21在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中能促進(jìn) mBMSCs的成骨分化。
　　3、在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏