甜瓜屬人工異源雙二倍體Cucumis hytivus早期世代遺傳與表觀遺傳變化.pdf

1、多倍化是高等植物進化過程的重要階段，是植物進化的主要動力之一。研究表明，異源多倍體在形成的早期會出現(xiàn)廣泛的基因組遺傳和表觀遺傳變化，這些變化直接關(guān)系到物種的形成和穩(wěn)定.然而，現(xiàn)存的天然多倍體大多形成于成千上萬年前，很難確定進化中種種不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)生的具體過程和機制.雖然分子標記及比較基因組學(xué)的發(fā)展為認識雜交及多倍化進程提供了重要依據(jù)，但由于分子進化機制的復(fù)雜性，這方面的相關(guān)機理知之甚少. 人工合成的異源多倍體則為這方面的研究提供了

2、良好的模式系統(tǒng)。通過這種模式系統(tǒng)，可以精確比較親本二倍體種與人工異源多倍體早期世代間的基因組變化特點，從而為豐富多倍體物種進化理論提供重要的實證.本研究基于實驗室已合成的甜瓜屬遠緣雜種F1及人工合成的異源雙二倍體及其不同自交世代，比較研究了雜種F1及異源雙二倍體的減數(shù)分裂染色體行為特征、基因組位點變化和甲基化模式變化特點，探索了遠緣雜交與多倍化引發(fā)遠緣雜種F1和異源雙二倍體基因組發(fā)生遺傳和表觀遺傳變化的機制.具體如下： 1.遠緣

3、雜種F1及異源雙二倍體減數(shù)分裂染色體行為與花粉育性研究 研究了野生種C.hystrix(2n=2X=24)與栽培黃瓜C.sativus L.(2n=2X=14)遠緣雜種F1(2n=2X=19)、雙二倍體及雙二倍體(2n=4X=38)自交1～4代的減數(shù)分裂染色體行為特征與花粉育性。結(jié)果表明：減數(shù)分裂中期I，雜種F1花粉母細胞(pollen mother cell，PMC)染色體主要以單價體存在，染色體構(gòu)型為：16.75I+0.5I

4、I+0.25III+0.13IV；雙二倍體染色體構(gòu)型以二價體為主，伴隨著自交，平均每個PMC所含二價體比例逐漸增加，非二價體配對比例減少.四分體時期，F(xiàn)1不能形成正常的四分孢子，主要以多分孢子形態(tài)存在；雙二倍體以四分孢子為主，并隨著自交世代的增高，其比例增加.花粉育性觀察發(fā)現(xiàn)，隨著自交世代的增高，雙二倍體花粉育性呈增加趨勢.以上結(jié)果暗示雙二倍體在遺傳上逐漸趨于穩(wěn)定。雙二倍體PMCs在后期I、II普遍含有落后染色體、染色體橋及染色體不均等

5、分離等異常現(xiàn)象，這可能是導(dǎo)致其花粉育性低于期望值的原因. 2.甜瓜屬遠緣雜種F1及人工異源雙二倍體早期基因組序列變化研究 利用12對Eco RI/Mse I選擇性引物，對甜瓜屬人工異源雙二倍體C.hytivus及其二倍體父母本進行AFLP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多倍體基因組在形成早期發(fā)生了廣泛的序列變化.基因組序列變化始于F1代，變化最劇烈的時期發(fā)生在S0到S1代。但在S1到S2代基因組序列變化比率基本接近，暗示了伴隨著異源雙二倍

6、體的自交過程，早期基因組表現(xiàn)出穩(wěn)定的趨勢，說明基因組序列變化是一個快速的事件.基因組序列變化主要表現(xiàn)為部分親本片段丟失、新片段產(chǎn)生以及后代對親本某些位點的跳躍式繼承。對變化的序列進行深入研究發(fā)現(xiàn)，變化的序列主要是重復(fù)序列。實驗還觀察到少部分雙親差異性條帶呈現(xiàn)出偏父性遺傳的特點. 不同分類群的異源多倍體在二倍化過程中，正反交序列丟失往往表現(xiàn)出不同特征，暗示了在不同物種中核質(zhì)互作在多倍體進化過程的作用不同.為了研究細胞質(zhì)背景對基因組

7、序列丟失的影響，利用23對Eco RI-NN/Mse I-NNN選擇性引物對Cucumishystrix與栽培黃瓜C.sativus的正反交F1、異源雙二倍體及親本DNA進行AFLP分析。結(jié)果表明：雜種F1與異源雙二倍體基因組發(fā)生了廣泛的序列丟失。正交后代與反交后代在丟失親本基因組序列的頻率上差異不顯著，并且在序列丟失時間(均始于F1代)及丟失類型上也表現(xiàn)出相同的特點，表明核質(zhì)互作并不是影響序列丟失的主要因素。實驗還發(fā)現(xiàn)，不論正交還是反

8、交，后代丟失普通黃瓜基因組序列數(shù)大于丟失野生種基因組序列數(shù)，表明甜瓜屬多倍化早期階段易于丟失染色體數(shù)比較少的親本基因組序列。 3.甜瓜屬遠緣雜交及多倍化誘發(fā)基因組DNA胞嘧啶甲基化變化特征研究 為了研究DNA甲基化在甜瓜屬人工異源多倍體形成過程中的作用，利用methylation-sensitive amplification polymorphism(MSAP)技術(shù)，對甜瓜屬遠緣雜種F1、人工異源雙二倍體及親本基因組D

9、NA進行研究.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遠緣雜種F1及人工異源雙二倍體基因組發(fā)生了胞嘧啶甲基化模式變化，表明遠緣雜交及多倍化均可誘發(fā)基因組胞嘧啶甲基化發(fā)生變化.甲基化變化根據(jù)變化模式的不同可以分為五種類型，主要是脫甲基化類型(甲基化水平降低)和過甲基化類型(甲基化水平升高)，并且發(fā)生過甲基化變化的位點數(shù)是發(fā)生脫甲基化變化的2-4倍，說明甲基化變化主要表現(xiàn)為親本基因組的部分位點在后代中發(fā)生過甲基化.研究還發(fā)現(xiàn)，與父本基因組相比，母本基因組在遠緣雜交后代中

10、易發(fā)生過甲基化變化，暗示了DNA甲基化在識別和保護自身DNA中起重要作用.對異源雙二倍體不同自交世代甲基化進行研究，在S1和S2代之間發(fā)生甲基化模式變化的位點數(shù)顯著多于S2和S3代，表明伴隨著自交世代的升高，雙二倍體基因組胞嘧啶甲基化變化劇烈程度逐漸降低，基因組逐漸趨于穩(wěn)定，DNA甲基化可能在遺傳二倍化過程中起重要作用. 為了研究甜瓜屬異源雙二倍體在形成及穩(wěn)定過程中甲基化變化位點的特征特性，我們對遠緣雜交及多倍化誘發(fā)的基因組胞嘧

11、啶甲基化變化位點進行分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在克隆測序的15條序列中，有7條序列與已知功能基因或調(diào)控基因具有較高的相似性，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計特異引物，進行PCR驗證分析，發(fā)現(xiàn)MSAP多態(tài)性由DNA甲基化修飾引起。并且RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)胞嘧啶甲基化可能參與了甜瓜屬人工異源雙二倍體基因表達的調(diào)控，表明其在異源多倍體二倍體化過程中起到重要作用。Southernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲基化變化序列不僅有單拷貝序列，而且也有部分是多拷貝序列. 為了研