miR-148a在膀胱癌組織中的異常表達(dá)及初步臨床意義探討.pdf

1、目的：
　　 采用Trizol提取膀胱上皮移形細(xì)胞癌(TCCB)及正常膀胱粘膜組織(NBE)的總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測miR-148a在TCCB組及NBE組織中的相對(duì)表達(dá)量，分析比較miR-148a在兩組間的相對(duì)表達(dá)量是否有顯著性差異，并進(jìn)一步結(jié)合臨床資料來分析TCCB組不同病理分級(jí)之間以及不同臨床分期組之間miR-148a的相對(duì)表達(dá)量是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)miR-148a在膀胱癌組織中的臨床意義進(jìn)行初步探討，并

2、為進(jìn)一步研究miR-148a在膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中可能的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.從2011年到2012年，采集溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院及浙江大學(xué)附屬浙二醫(yī)院泌尿外科診療中心膀胱腫瘤患者標(biāo)本，按照膀胱癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)收集BCa組織66例為實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)病理證實(shí)均為膀胱上皮移形細(xì)胞癌(TCCB)，以及外傷性膀胱破裂患者正常膀胱粘膜組織18例為對(duì)照組，經(jīng)病理證實(shí)均為正常膀胱粘膜組織(NBE)。標(biāo)本取得后迅速冷凍于液

3、氮中，隨后放置于-80℃低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>　　 2.采用美國Invitrogen公司的TRIzol(@) Reagent Kit對(duì)膀胱癌組織和正常對(duì)照粘膜組織進(jìn)行總RNA的抽提，流程步驟為:組織勻漿、分離相、RNA沉淀、RNA洗滌和RNA溶解。操作過程嚴(yán)格按照原裝試劑盒的說明書進(jìn)行操作。采用Thermo NanoDrop2000分光光度計(jì)（美國Thermo公司）對(duì)總RNA濃度及純度進(jìn)行檢測。
　　 3.采用美國ABI

4、(Applied Biosystems)公司的TaqMan(@) MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒及TaqMan(@) MicroRNA Assays的特異性引物miRNA-specific RT primer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程，把總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，整個(gè)準(zhǔn)備過程需要在冰上操作。使用美國ABI公司的stepone plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程，反應(yīng)條件為:16℃30min;4

5、2℃30min;85℃5min;4℃∞。逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增過程。
　　 4.采用美國ABI公司的TaqMan(@)MicroRNA Assays試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增過程:PCR反應(yīng)體系需要加入TaqMan(@) MicroRNA Assays的上下游引物及探針miRNA-specific forward PCR primer, reverse PCR primer和Taqman MGB probe的混合物，內(nèi)參U6

6、和miR-148a的逆轉(zhuǎn)錄引物，以及TaqMan(@) UniversalMaster MixⅡ(No UNG，即不含尿嘧啶-N-糖苷酶)。反應(yīng)體系所有試劑需要在冰上準(zhǔn)備，整個(gè)體系不能有氣泡存在。擴(kuò)增過程利用美國ABI公司的stepone plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行，擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)如下:95℃，10mins;95℃，15s，60℃，60s，一共40個(gè)循環(huán)。
　　 5.擴(kuò)增結(jié)束后適當(dāng)調(diào)整基線，擴(kuò)增曲線與基線的交叉點(diǎn)即為Ct值

7、(Cycle threshold))。根據(jù)各樣本miR-148a和所對(duì)應(yīng)U6的Ct值，采用相對(duì)定量方法計(jì)算原組織標(biāo)本中miR-148a的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表示為2-△Ct(△Ct=CtmiR-148a-CtU6)。
　　 6.用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:各分組相對(duì)表達(dá)量呈偏態(tài)分布用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，不同膀胱組織類型miR-148a的表達(dá)差異用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩樣本比較的Mann-Whitney U檢驗(yàn);TCCB組

8、中不同病理分級(jí)間的差異用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn);TCCB組不同臨床分期(Tis+T1)和(T2+T3+T4)間的差異用兩個(gè)獨(dú)立樣本比較的Mann-Whitney U檢驗(yàn)，均設(shè)p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.TCCB組織及NBE組織的RNA濃度測定:所有樣品A260/A280在1.8-2.0之間，RNA純度較高，無DNA、蛋白質(zhì)等污染，可以為下游實(shí)驗(yàn)提供合格樣本。
　　

9、2.用ABI stepone plus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)TCCB組與NBE組進(jìn)行miR-148a的相對(duì)表達(dá)量的檢測，經(jīng)兩獨(dú)立樣本Mann-Whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示:TCCB組中miR-148a的相對(duì)表達(dá)量明顯低于NBE組，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異，z值為-5.22(p＜0.001)。
　　 3.對(duì)miR-148a在膀胱癌診斷中進(jìn)行效能評(píng)估，發(fā)現(xiàn)miR-148a對(duì)于膀胱癌診斷的特異性非常高，達(dá)到94.4

10、％，陽性預(yù)測值為97.87％。使用Pearson卡方檢驗(yàn)再次驗(yàn)證miR-148a的表達(dá)在膀胱癌組織和正常組織中是否存在差異，同時(shí)檢測OR值進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。結(jié)果顯示:x20.05,1=23.609，P＜0.001，OR=39.1(4.87～314.23)，也就是說miR-148a相對(duì)表達(dá)量＜0.018時(shí)發(fā)生TCCB的概率為＞0.018時(shí)的39倍，具有非常明顯的臨床意義
　　 4.用多個(gè)樣本Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)方法對(duì)TCCB組不同病理分級(jí)（Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)）中的miR-148a相對(duì)表達(dá)量的差異性做組間分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較三個(gè)組別之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x20.05,1=2.66，P＞0.05)。
　　 5.在TCCB不同臨床分期組(T2+T3+T4)和（Tis原位癌+T1）之間經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Z=-0.60，P值＞0.05。
　　 結(jié)論:
　　 我們的研究結(jié)果顯示，

12、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法定量檢測TCCB及NBE組織中miR-148a的相對(duì)表達(dá)量，以NBE組為對(duì)照，miR-148a在TCCB組中的表達(dá)是明顯降低的。對(duì)miR-148a在膀胱癌診斷中進(jìn)行效能評(píng)估，發(fā)現(xiàn)miR-148a對(duì)于膀胱癌診斷的特異性非常高，達(dá)到94.4％，陽性預(yù)測值為97.87％。用卡方檢驗(yàn)對(duì)OR值進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，得出miR-148a相對(duì)表達(dá)量＜0.018時(shí)發(fā)生TCCB的概率為＞0.018時(shí)的39倍，具有非常明顯的臨床意義。此外發(fā)

13、現(xiàn)miR-148a的表達(dá)在膀胱癌組中不同病理分級(jí)（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)）之間以及不同臨床分期組之間均沒有顯著性差異，提示miR-148a可能在膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著抑癌基因的作用。為miR-148a在BCa腫瘤形成及腫瘤治療方面提供了新的視點(diǎn)。接下去我們的思路將繼續(xù)收集不同分級(jí)的癌組織標(biāo)本，找出miR-148a在膀胱癌中的關(guān)鍵靶基因，繼續(xù)探討其在BCa中的發(fā)病機(jī)制，以及與腫瘤侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)，論證miR-148a可以作為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移