廣西雞源致病性沙門氏菌流行優(yōu)勢菌株血清型及耐藥性的研究.pdf

1、沙門氏菌可以引起雞白痢、雞傷寒和禽副傷寒，具有垂直傳播和水平傳播的特點，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要病原菌。廣西是養(yǎng)雞大省，年飼養(yǎng)量超過10億羽，掌握當(dāng)前廣西雞源致病性沙門氏菌的流行優(yōu)勢菌株及其耐藥特點，對雞沙門氏菌病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。
　　1.雞源致病性沙門氏菌多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用
　　根據(jù)GenBank中發(fā)表的沙門氏菌屬特異性毒力基因invA、質(zhì)粒毒力基因spvR、雞宿主特異性毒力基因fliC的序列，利用Pr

2、imerExpress3.0軟件設(shè)計合成了3對特異性引物。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測雞源致病性沙門氏菌的多重PCR方法。該方法可以特異性地擴增攜帶毒力質(zhì)粒的致病性雞沙門氏菌，而與大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、志賀氏痢疾桿菌及普通變形桿菌均無交叉反應(yīng);對沙門氏菌菌液的檢出下限為4.5×102 CFU/mL，對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出下限為1.67×103拷貝/μL。應(yīng)用所建立的方法，對采集的310份臨床病料進行檢測，結(jié)果檢出invA基因陽性3

3、4份，占10.97％，其中invA+spvR基因陽性20份，占6.45％;invA+fliC基因陽性2份，占0.65％;invA+spvR+fliC基因陽性12份，占3.87％。
　　2.雞源致病性沙門氏菌的分離鑒定及血清型和藥敏性分析
　　采集疑似病雞的組織病料，對沙門氏菌進行增菌和分離培養(yǎng)，對分離菌株運用VITEK System ATB Expression法ID32E腸桿菌鑒定試劑條進行生化試驗鑒定，應(yīng)用玻片凝集試驗進

4、行血清型鑒定，采用ATB VET藥敏試劑條對28種腸桿菌抗菌藥物進行藥敏性試驗。結(jié)果，從310份疑似雞病料中分離鑒定出34株致病性沙門氏菌;這些分離菌株中有A群1株、C2群1株、B群14株和D群14株，另有3株未定型，其中以B群鼠傷寒沙門氏菌和D群雞白痢沙門氏菌為優(yōu)勢菌株;34株分離株對大觀霉素和安普霉素全部敏感，對氯霉素、卡那霉素、慶大霉素的耐藥率小于10％，對阿莫西林、鏈霉素、氟甲喹、惡喹酸、磺胺甲惡唑、四環(huán)素和呋喃妥因耐藥率介于5

5、0％和90％之間，而對青霉素、苯唑西林、夫西地酸、利福平和甲硝唑的耐藥率達到100％，并且存在多重耐藥現(xiàn)象。
　　3.雞源沙門氏菌耐藥性與耐藥基因和血清群的相關(guān)性分析
　　為研究沙門氏菌分離株耐藥表型與耐藥基因和血清群之間的關(guān)系，對血清型鑒定為B群和D群的29株雞源致病性沙門氏菌，采用ATB VET藥敏試劑條法對20種抗菌藥物進行敏感性測定，應(yīng)用PCR技術(shù)對這些抗菌藥物19種相關(guān)耐藥基因進行檢測。結(jié)果，29株沙門氏菌分離株中

6、，青霉素、苯唑西林的耐藥率最高(100％)，耐藥率超過50％的還有磺胺甲惡唑(82.76％)、鏈霉素(75.86％)、惡喹酸(75.86％)、氟甲喹(65.52％)、恩諾沙星(55.17％)、四環(huán)素(55.17％)、阿莫西林(51.72％)，而對大觀霉素、慶大霉素、安普霉素、氯霉素、多粘菌素E沒有出現(xiàn)耐藥性。所有29個分離株至少對6種抗菌藥物具有耐藥性，以6～7重耐藥為主（占51.73％），最高可達14重耐藥（占3.45％）。所檢測的1

7、9種耐藥基因中，共檢測到14種耐藥基因，其中blaTEM檢出率最高(100％)，檢出率超過40％的還有aadA1(62.07％)、Sul2(62.07％)、Sul3(51.72％)、tetA(48.28％)、qnrA(44.83％)，而blaPsE、aadA2、tetG、tetM、tetX未能檢出。所有29個分離株至少攜帶2種耐藥基因，以攜帶4～6種耐藥基因為主（占79.31％），最多者攜帶10種耐藥基因（占3.45％）。B血清群和D血

8、清群的耐藥表型和耐藥基因攜帶率沒有明顯的差異。表明，廣西雞源致病性沙門氏菌耐藥性及多重耐藥性非常普遍，耐藥表型與相關(guān)耐藥基因檢出率呈正相關(guān)，而與血清群之間無明顯的相關(guān)性。
　　4.超級細菌blaNDM-1基因TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用
　　為建立快速檢測超級細菌編碼新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶1(NDM-1)的blaNDM-1基因的方法，針對blaNDM-1及其變異體的基因序列設(shè)計一對特異性引物和一條M

9、GB探針，以構(gòu)建的含有blaNDM-1基因片段的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功建立了檢測blaNDM-1基因的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法。該方法可以特異性擴增blaNDM-1基因重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，而對雞白痢沙門氏菌、大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株為陰性;檢出下限為2.59拷貝/μL，比常規(guī)PCR敏感性高100倍;重復(fù)性試驗的變異系數(shù)小于1.5％。應(yīng)用所建立的方法對34株雞源致病性沙門氏菌分

10、離株進行檢測，結(jié)果均未檢測到目的條帶，所有分離株均沒有攜帶 blaNDM-1基因。表明，本研究建立的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法特異性強、敏感性高、重復(fù)性好，可用于監(jiān)測攜帶blaNDM-1基因及其變異體的超級細菌。
　　綜上所述，本研究基于沙門氏菌屬特異性毒力基因invA、沙門氏菌雞宿主特異性基因fliC以及沙門氏菌質(zhì)粒毒力基因spvR，成功建立了鑒別檢測雞源致病性沙門氏菌的多重PCR方法;對廣西當(dāng)前雞源致病性沙門氏菌進