人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物對(duì)肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：本研究旨在體外分離培養(yǎng)和鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（humanumbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs），初步鑒定UCMSCs的生物學(xué)特性；探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌物的收集方法；探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUCMSC）分泌物在體外對(duì)肝細(xì)胞再生、凋亡及其功能的影響。
　　 方法：（1）無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶，利用PBS沖洗臍動(dòng)脈及臍靜脈，將血液沖洗干凈，將其剪碎至1mm

2、3后，加入0.1％Ⅳ型膠原酶消化60分鐘，然后加入0.25％胰酶消化30分鐘，利用濾網(wǎng)過濾后收集細(xì)胞，DMEM（5％FBS）重懸細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80-90％融合后進(jìn)行1:3傳代培養(yǎng)，取傳代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、生長活性檢測(cè)、細(xì)胞周期分析；（2）制備含UCMSC分泌物的MSC條件培養(yǎng)基（Conditioned medium，MSC-CM），將UCMSC培養(yǎng)至第五代，待細(xì)胞70％至80％融合時(shí)，

3、充分洗滌培養(yǎng)瓶，倒入15mL，含有0.05％牛血清白蛋白的DMEM，24小時(shí)后收集此培養(yǎng)基，用3kDa的離心超濾管濃縮22倍，把濃縮后的培養(yǎng)基定義為100％濃度的MSC的條件培養(yǎng)基。2％MSC-CM（2％MSC-CM+98％肝細(xì)胞培養(yǎng)基），8％MSC-CM（8％MSC-CM+92％肝細(xì)胞培養(yǎng)基）。（3）采用低濃度膠原酶原位循環(huán)灌流法分離肝細(xì)胞，取SD大鼠，乙醚麻醉、肝素腹腔注射抗凝，無菌常溫環(huán)境下固定于操作臺(tái)，剪開肌層，門靜脈插管，剪斷

4、下腔靜脈，用D-Hanks液灌洗凈血管內(nèi)血液，更換0.1％Ⅳ型膠原酶，灌洗10-20分鐘至肝質(zhì)變軟，壓之凹陷不易恢復(fù)后，撕碎肝臟并祛除纖維結(jié)締組織，制成混合細(xì)胞懸液，篩網(wǎng)過濾，500rpm離心，去上清，收集肝細(xì)胞，根據(jù)試驗(yàn)需求接種于相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)。0.4％臺(tái)盼藍(lán)染色判斷肝細(xì)胞活性；實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、2％MSC-CM組和8％MSC-CM組。（4）MTT比色法觀察不同濃度MSC-CM對(duì)正常肝細(xì)胞增殖的影響：肝細(xì)胞接種于基底膜基質(zhì)鋪底的96孔

5、培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)后，移去含10％胎牛血清的肝細(xì)胞培養(yǎng)基，然后加入含0.4％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞同步化于G0期，移去培養(yǎng)液，加入含5％胎牛血清及含不同濃度MSC-CM的肝細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。MTT比色法檢測(cè)肝細(xì)胞增殖情況。（5）不同濃度MSC-CM對(duì)正常肝細(xì)胞功能的影響：肝細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的MSC-CM，24小時(shí)后收集培養(yǎng)上清液，Albumin Assay Kit和Urea A

6、ssay Kit測(cè)定不同濃度MSC-CM組的肝細(xì)胞上清液中白蛋白、尿素的濃度。（6）誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、MSC-CM處理及肝細(xì)胞活性分析：肝細(xì)胞在基底膜基質(zhì)預(yù)鋪底的12孔板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)5天后，在培養(yǎng)基內(nèi)加放線菌素D（0.2μg/mL）1小時(shí)，然后加入腫瘤壞死因子α（30ng/mL），誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，與此同時(shí)2％MSC-CM組和8％MSC-CM組分別加入相應(yīng)濃度的MSC-CM，培養(yǎng)8小時(shí)后觀察肝細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果：（1）利用膠原酶及

7、胰酶兩步消化法能充分消化臍帶，細(xì)胞易于獲得，收集細(xì)胞后進(jìn)行原代培養(yǎng)，24小時(shí)可觀察到貼壁細(xì)胞，待生長至10天時(shí)可見細(xì)胞長滿瓶底，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每周傳代1次。觀察細(xì)胞形態(tài)為長梭形，不規(guī)則形，細(xì)胞大小不一，類似成纖維細(xì)胞，呈漩渦樣生長。取第5-9代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)CD29、CD49、CD90、CD105、HLA-1，基本不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD45，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31。MTT實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞倍增時(shí)間為23h。細(xì)胞周期分析表明7

8、5％-85％細(xì)胞處于G0/G1。濃縮后的MSC-CM中含有高濃度的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌物。（2）MTT法測(cè)定肝細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較，2％MSC-CM組吸光度（A）540nm值明顯增加（P<0.01），而8％MSC-CM組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。測(cè)定2％MSC-CM組尿素和白蛋白的含量均高于其他兩組（P<0.01），而對(duì)照組和8％MSC-CM組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞活性分析試劑盒檢測(cè)，2％MSC-CM組肝細(xì)胞存活率增加（P<0

9、.05），而8％MSC-CM組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：經(jīng)酶消化法從臍帶中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞，易于收集，體外增殖能力強(qiáng)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞基本的生物學(xué)特性，有望在干細(xì)胞的研究及臨床應(yīng)用方面發(fā)揮重要的作用。MSC分泌物易于收集，臨床應(yīng)用非常便利。低濃度的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物具有刺激正常肝細(xì)胞再生，抑制受損肝細(xì)胞凋亡，改善肝細(xì)胞功能等作用，為FHF的治療提供了一種新思路。而高濃度的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物不具有上述