人臍帶間充質干細胞分泌物對肝細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：本研究旨在體外分離培養(yǎng)和鑒定人臍帶間充質干細胞（humanumbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs），初步鑒定UCMSCs的生物學特性；探討人臍帶間充質干細胞旁分泌物的收集方法；探討人臍帶間充質干細胞（HUCMSC）分泌物在體外對肝細胞再生、凋亡及其功能的影響。
　　 方法：（1）無菌條件下收集剖宮產新生兒臍帶，利用PBS沖洗臍動脈及臍靜脈，將血液沖洗干凈，將其剪碎至1mm

2、3后，加入0.1％Ⅳ型膠原酶消化60分鐘，然后加入0.25％胰酶消化30分鐘，利用濾網過濾后收集細胞，DMEM（5％FBS）重懸細胞接種于培養(yǎng)瓶內進行原代培養(yǎng)，待細胞生長至80-90％融合后進行1:3傳代培養(yǎng)，取傳代培養(yǎng)細胞進行形態(tài)學觀察、流式細胞儀檢測、生長活性檢測、細胞周期分析；（2）制備含UCMSC分泌物的MSC條件培養(yǎng)基（Conditioned medium，MSC-CM），將UCMSC培養(yǎng)至第五代，待細胞70％至80％融合時，

3、充分洗滌培養(yǎng)瓶，倒入15mL，含有0.05％牛血清白蛋白的DMEM，24小時后收集此培養(yǎng)基，用3kDa的離心超濾管濃縮22倍，把濃縮后的培養(yǎng)基定義為100％濃度的MSC的條件培養(yǎng)基。2％MSC-CM（2％MSC-CM+98％肝細胞培養(yǎng)基），8％MSC-CM（8％MSC-CM+92％肝細胞培養(yǎng)基）。（3）采用低濃度膠原酶原位循環(huán)灌流法分離肝細胞，取SD大鼠，乙醚麻醉、肝素腹腔注射抗凝，無菌常溫環(huán)境下固定于操作臺，剪開肌層，門靜脈插管，剪斷

4、下腔靜脈，用D-Hanks液灌洗凈血管內血液，更換0.1％Ⅳ型膠原酶，灌洗10-20分鐘至肝質變軟，壓之凹陷不易恢復后，撕碎肝臟并祛除纖維結締組織，制成混合細胞懸液，篩網過濾，500rpm離心，去上清，收集肝細胞，根據試驗需求接種于相應培養(yǎng)基培養(yǎng)。0.4％臺盼藍染色判斷肝細胞活性；實驗分組：對照組、2％MSC-CM組和8％MSC-CM組。（4）MTT比色法觀察不同濃度MSC-CM對正常肝細胞增殖的影響：肝細胞接種于基底膜基質鋪底的96孔

5、培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時后，移去含10％胎牛血清的肝細胞培養(yǎng)基，然后加入含0.4％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時，使細胞同步化于G0期，移去培養(yǎng)液，加入含5％胎牛血清及含不同濃度MSC-CM的肝細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。MTT比色法檢測肝細胞增殖情況。（5）不同濃度MSC-CM對正常肝細胞功能的影響：肝細胞接種于12孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的MSC-CM，24小時后收集培養(yǎng)上清液，Albumin Assay Kit和Urea A

6、ssay Kit測定不同濃度MSC-CM組的肝細胞上清液中白蛋白、尿素的濃度。（6）誘導肝細胞凋亡、MSC-CM處理及肝細胞活性分析：肝細胞在基底膜基質預鋪底的12孔板內常規(guī)培養(yǎng)5天后，在培養(yǎng)基內加放線菌素D（0.2μg/mL）1小時，然后加入腫瘤壞死因子α（30ng/mL），誘導肝細胞凋亡，與此同時2％MSC-CM組和8％MSC-CM組分別加入相應濃度的MSC-CM，培養(yǎng)8小時后觀察肝細胞活性。
　　 結果：（1）利用膠原酶及

7、胰酶兩步消化法能充分消化臍帶，細胞易于獲得，收集細胞后進行原代培養(yǎng)，24小時可觀察到貼壁細胞，待生長至10天時可見細胞長滿瓶底，進行傳代培養(yǎng)，每周傳代1次。觀察細胞形態(tài)為長梭形，不規(guī)則形，細胞大小不一，類似成纖維細胞，呈漩渦樣生長。取第5-9代細胞經流式細胞儀檢測表達CD29、CD49、CD90、CD105、HLA-1，基本不表達造血細胞標志CD34、CD45，內皮細胞標志CD31。MTT實驗顯示細胞倍增時間為23h。細胞周期分析表明7

8、5％-85％細胞處于G0/G1。濃縮后的MSC-CM中含有高濃度的臍帶間充質干細胞旁分泌物。（2）MTT法測定肝細胞增殖，與對照組比較，2％MSC-CM組吸光度（A）540nm值明顯增加（P<0.01），而8％MSC-CM組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。測定2％MSC-CM組尿素和白蛋白的含量均高于其他兩組（P<0.01），而對照組和8％MSC-CM組比較無統(tǒng)計學差異。細胞活性分析試劑盒檢測，2％MSC-CM組肝細胞存活率增加（P<0

9、.05），而8％MSC-CM組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：經酶消化法從臍帶中獲得的間充質干細胞，易于收集，體外增殖能力強，符合間充質干細胞基本的生物學特性，有望在干細胞的研究及臨床應用方面發(fā)揮重要的作用。MSC分泌物易于收集，臨床應用非常便利。低濃度的臍帶間充質干細胞分泌物具有刺激正常肝細胞再生，抑制受損肝細胞凋亡，改善肝細胞功能等作用，為FHF的治療提供了一種新思路。而高濃度的臍帶間充質干細胞分泌物不具有上述