性早熟差異表達(dá)基因的克隆和鑒定及滋陰瀉火中藥合劑對(duì)差異基因的影響.pdf

1、性早熟是一種生長(zhǎng)發(fā)育異常性疾病,男女兒童中該病的發(fā)病率約為0.6％.但真性性早熟的病因仍不清楚.該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法,在達(dá)那唑誘導(dǎo)的性早熟大鼠模型上,克隆和鑒定性早熟大鼠下丘腦差異表達(dá)的基因,并初步觀察了模型鼠和患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中差異基因的表達(dá),以探討性早熟的發(fā)病機(jī)制和中藥治療性早熟的機(jī)理.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.5日齡雌性大鼠皮下注射達(dá)那唑后,大鼠陰門開啟和出現(xiàn)第一個(gè)性周期的時(shí)間分別為25.97±2.24天和32

2、.43±0.75天,比正常組的34.00±0.98天和41.26±2.35天及載體組的34.33±1.09天和40.00±0.19天均顯著提前(P<0.01);模型組大鼠出現(xiàn)第一個(gè)動(dòng)情周期時(shí),卵巢和子宮的臟器系數(shù)也分別比正常組和載體組的明顯增加(P<0.01).另外模型組大鼠陰道脫落上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)周期性變化和正常成熟大鼠的相似.結(jié)果提示,達(dá)那唑可誘導(dǎo)雌性大鼠的性發(fā)育顯著提前,該模型是一種較理想的真性性早熟大鼠模型.2.應(yīng)用隨機(jī)引物PC

3、R(RNA arbitrarily primed PCR,RAP-PCR)方法從達(dá)那唑誘導(dǎo)的性早熟模型大鼠下丘腦共分離得到5條差異表達(dá)基因的cDNA片段,其中包括生殖調(diào)控體系的關(guān)鍵分子GnRH的cDNA.該文應(yīng)用Dot blot鑒定了GnRHmRNA在大鼠下丘腦的表達(dá),發(fā)現(xiàn)模型組下丘腦GnRHmRNA的表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì).另外一條差異表達(dá)基因,我們將其命名為IPP-1(idiopathic precocious puberty),Blast

4、檢索GeneBank發(fā)現(xiàn),其與homo sapiens KIAA1538基因的同源性達(dá)84％,應(yīng)用Dot blot和Northern blot分析發(fā)現(xiàn),IPP-1mRNA在模型組大鼠下丘腦的表達(dá)下調(diào).3.應(yīng)用RT-PCR方法觀察到,滋阻瀉火中藥合劑可下調(diào)下丘腦GnRHmRNA和垂體GnRH受體mRNA的表達(dá).應(yīng)用免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn),滋阻瀉火中藥合劑可以誘導(dǎo)性早熟模型大鼠下丘腦GnRH免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加,我們推測(cè)滋陰瀉火中藥合劑可能通過

5、抑制下丘腦GnRH的釋放,緩解提前啟動(dòng)的下丘腦—垂體—性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonad axis,HPGA)功能.另外,滋阻瀉火中藥合劑可顯著上調(diào)性早熟差異基因IPP-1的表達(dá).提示滋阻瀉火中藥合劑可在分子水平通過調(diào)整異常的基因表達(dá),使HPGA的異常功能趨于正?；?4.應(yīng)用RT-PCR的方法觀察到,在大鼠及不同年齡和性早熟兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)均有GnRHmRNA的表達(dá),模型組大鼠其表達(dá)增加,性早熟患兒(

6、n=2)外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)GnRHmRNA的表達(dá)較正常發(fā)育兒童(4歲、6歲、8歲)有升高趨勢(shì).我們推測(cè)外周組織細(xì)胞產(chǎn)生的GnRH可能通過旁分泌作用于垂體之外的組織細(xì)胞上的GnRH受體,調(diào)節(jié)卵巢卵泡的發(fā)育和性甾體激素的產(chǎn)生.雖然在外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)觀察到了KIAA1538mRNA的表達(dá),但兒童及大鼠各組之間表達(dá)水平無顯著差異.總之,兒童性早熟可能是一種涉及到基因調(diào)控和表達(dá)的疾病,滋阻瀉火中藥合劑可從分子水平,在多個(gè)層次調(diào)整異常的HPGA功