Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、第一部分
　　 目的：研究Snail基因在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)，Snail 對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)性狀及生長(zhǎng)等方面的影響，探討骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為Snail基因受體細(xì)胞的可行性。
　　 方法：采用密度梯度離心法、貼壁篩選法并結(jié)合傳代對(duì)成人骨髓MSC 進(jìn)行純化和體外擴(kuò)增，觀察細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物的表達(dá)特點(diǎn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓MSC 表面抗原表達(dá)，脂質(zhì)體法將重組真核表達(dá)載體(pCAGGSneo-snail-

2、HA)及對(duì)照空質(zhì)粒(pCAGGSneo)轉(zhuǎn)染MSCs，G418 篩選穩(wěn)定表達(dá)，繪制轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，分別于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和4周利用免疫熒光染色技術(shù)及免疫印跡法檢測(cè)MSCs 報(bào)告基因HA 及目的基因Snail 表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：成人骨髓MSC 培養(yǎng)3天后有散在呈針尖狀的貼壁細(xì)胞，7～10天后形成集落或融合呈纖維狀，3周左右細(xì)胞生長(zhǎng)可匯合至80-90[％]，間充質(zhì)樣細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，走向趨向一致，傳代后1周左右即可融合，3～5

3、 代后基本純化，細(xì)胞形態(tài)單一，細(xì)胞排列具有典型的旋渦狀結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：CD34 表達(dá)陰性及CD29 表達(dá)陽(yáng)性；500μg/ml的G418是最適篩選濃度，pCAGGSneo-Snail-HA 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期的MSCs在蛋白水平均可檢測(cè)到目的基因snail 及報(bào)告基因HA的表達(dá)；生長(zhǎng)曲線示重組真核表達(dá)載體(pCAGGSneo-snail-HA)及對(duì)照空質(zhì)粒(pCAGGSneo)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞(即MSCs-Sna和MSCs-neo

4、)生長(zhǎng)曲線與未轉(zhuǎn)染的同代MSCs 相比，倍增時(shí)間稍稍延長(zhǎng)，一代時(shí)間約比未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞多一天，而MSCs-Sna和MSCs-neo 之間倍增時(shí)間及一代時(shí)間沒(méi)有明顯差異。
　　 結(jié)論：分離培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞且成分單一，第3、5 代細(xì)胞很純且生長(zhǎng)旺盛，適用于做轉(zhuǎn)染或以后的研究，pCAGGSneo-snail-HA 可以在MSCs 內(nèi)獲得瞬時(shí)和長(zhǎng)期表達(dá)，且Snail 表達(dá)對(duì)MSCs的生長(zhǎng)速度無(wú)明顯影響。MSCs 可以作為Snail基

5、因的受體細(xì)胞，為下一步研究Snail 對(duì)MSCs 遷移趨化、存活抗凋亡及基質(zhì)金屬蛋白酶2分泌等生物學(xué)特性的影響奠定基礎(chǔ)。
　　 第二部分
　　 目的：探討Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移力的影響，及磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinosital3-kinase，PI-3K)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)及P38

6、絲裂原活化的蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase，P38 MAPK)等信號(hào)通路在Snail 轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力改變中的調(diào)控作用。
　　 方法：采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、Western Blot方法檢測(cè)Snail基因修飾后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)PI3K、ERK1/2和P38/MAPK 信號(hào)通路的表達(dá)變化，用跨膜遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell 實(shí)驗(yàn))來(lái)評(píng)價(jià)MSCs的侵襲遷移能力，比較轉(zhuǎn)染S

7、nail 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染對(duì)照空質(zhì)粒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的差異，并比較用和不用各信號(hào)通路干預(yù)劑的差異。
　　 結(jié)果：Western blot 結(jié)果表明，MSCs-Sna 細(xì)胞P-ERK1/2與總ERK1/2的比值顯著高于MSCs-neo組。同時(shí)，MSCs-Sna 細(xì)胞內(nèi)p-Akt與總Akt的比值較MSCs-neo組亦顯著性增加。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示P-ERK1/2、p-Akt在MSCs-neo 中均為較弱的綠色熒光，且多分布在細(xì)胞胞

8、漿內(nèi)。而在MSCs-Sna 中P-ERK1/2、p-Akt 熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，核內(nèi)亦存在較多分布。P-P38在MSCs-neo和MSCs-Sna 細(xì)胞核和胞漿中均呈陰性表達(dá)。Transwell體外跨膜侵襲遷移實(shí)驗(yàn)顯示Snail 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs(MSCs-Sna)較對(duì)照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs(MSCs-neo)細(xì)胞遷移率增加，PI-3K 信號(hào)通路特異性抑制劑Wortmannin和ERK 通路抑制劑PD98059 能顯著抑制此遷移率的增加。各

9、濃度P38 通路抑制劑SB203580 對(duì)MSCs-neo和MSCs-Sna的跨膜遷移數(shù)量均無(wú)明顯抑制作用。
　　 結(jié)論：Snail基因修飾可增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞AKT、ERK1/2 磷酸化水平，并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移，PI3K 通路的特異性抑制劑Wortmannin和ERK 通路抑制劑PD98059 可分別抑制Snail 修飾誘導(dǎo)的AKT、ERK1/2的磷酸化，降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力；SB203580 對(duì)Snail

10、的促細(xì)胞遷移作用無(wú)明顯影響。PI3K和ERK 信號(hào)通路在Snail基因促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移功能的調(diào)控中可能發(fā)揮了重要作用。
　　 第三部分
　　 目的：觀察MSCs在Snail基因修飾后細(xì)胞膜表面相應(yīng)特異性受體CXCR4 表達(dá)水平、及對(duì)SDF-1的趨化能力的變化。為探索提高M(jìn)SCs 移植后向受損后局部常高表達(dá)SDF-1的器官組織趨化遷移能力的方法提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法：采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色、熒光標(biāo)記流

11、式細(xì)胞儀技術(shù)及RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)Snail基因修飾后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上CXCR4 受體的表達(dá)水平；采用體外Transwell 跨膜趨化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)MSCs 向SDF-1的趨向遷移能力，觀察大小不同濃度的抗CXCR4 中和抗體對(duì)趨化實(shí)驗(yàn)的干預(yù)作用。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)顯示，MSCs-neo和MSCs-Sna 細(xì)胞表面均有CXCR4 受體的表達(dá)，其中MSCs-Sna的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于MSCs-neo的陽(yáng)性表達(dá)率(64

12、.25[％]±7.22[％]vs.7.45[％]±0.91[％]，P<0.05)。
　　 結(jié)論：Snail 可上調(diào)MSCs 趨化因子受體CXCR4分子的表達(dá)，并可通過(guò)這一環(huán)節(jié)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)相應(yīng)趨化因子SDF-1的趨化作用，這提示了通過(guò)上調(diào)Snail的表達(dá)而提高M(jìn)SCs 向正調(diào)節(jié)表達(dá)SDF-1的受損組織(例如腦的缺血半暗帶等部位)遷移效率的可行性，為提高M(jìn)SCs的遷移能力及移植效率的研究方向提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為以后

13、進(jìn)一步開(kāi)展提高M(jìn)SCs 向受損組織器官遷移的在體實(shí)驗(yàn)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第四部分
　　 目的：觀察Snail 對(duì)骨髓MSCs在離體無(wú)血清培養(yǎng)下細(xì)胞骨架的變化及凋亡的影響，并研究Snail 對(duì)MSCs在含IL-4 培養(yǎng)基中發(fā)生凋亡的保護(hù)作用，為探索提高M(jìn)SCs移植后存活能力的方法提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法：MSCs-Sna 及MSCs-neo 于體外無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，β-Actin 免疫熒光細(xì)胞染色觀察

14、細(xì)胞骨架，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞Sub-G1 凋亡峰，及Annexin V/PI 雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率(Annexin V+/PI-[％])，并比較snail 轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的MSCs(即MSC-sna 及MSC-neo)在以上方面的差異。同樣的方法，MSCs-Sna 及MSCs-neo在含IL-4(20ng/ml)和不含IL-4的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)后，MS

15、Cs-Sna細(xì)胞骨架排列保持正常有序分布狀態(tài)，細(xì)胞長(zhǎng)極存在較長(zhǎng)的應(yīng)力纖維束，細(xì)胞輪廓清晰；而MSCs-neo細(xì)胞骨架排列出現(xiàn)紊亂，基本細(xì)胞形態(tài)尚保持。
　　 結(jié)論：經(jīng)Snail基因修飾，MSCs 骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及在體外無(wú)血清培養(yǎng)或IL-4 等促凋亡因素存在的環(huán)境中抗凋亡能力增加。
　　 第五部分
　　 目的:研究Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MMP-2 表達(dá)的影響，及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (extra

16、cellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和PI-3K/AKT 信號(hào)通路在Snail 轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MMP-2 表達(dá)改變中的調(diào)控作用。
　　 方法:應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將攜帶Snail基因的重組載體pCAGGSneo-Snail-HA 導(dǎo)入體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，用G418 篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞。采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2 mRNA的表達(dá)，明膠電泳酶譜分析細(xì)胞上清液中基質(zhì)金

17、屬蛋白酶2(MMP-2)的活力，并比較轉(zhuǎn)染Snail 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染對(duì)照空質(zhì)粒的MSCs的差異；阻斷實(shí)驗(yàn)以不同濃度ERK 激酶特異性抑制劑(PD98059)或和PI3K 通路特異性抑制劑(Wortmannin)干預(yù)后Western-blot檢測(cè)MSCs 細(xì)胞ERK、AKT 磷酸化水平變化，確定PD98059和Wortmannin分別抑制Snail 誘導(dǎo)的MSCs 細(xì)胞ERK 激酶和AKT 激酶磷酸化的有效濃度，進(jìn)而研究其對(duì)Snail 轉(zhuǎn)染M