鴨群中REV感染的流行病學(xué)調(diào)查及囊膜糖蛋白基因的序列分析.pdf

1、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是指由網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(ReticuloendotheliosisvirusREV)引起的雞、鴨、火雞和其它禽類包括急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤形成、生長抑制綜合癥、淋巴組織和其他組織的慢性腫瘤形成的病理綜合癥。這種疾病雖然不一定直接導(dǎo)致禽的死亡，但它們能降低其對其它疾病的抵抗力，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 REV可感染眾多鳥類，鴨是其常見的自然宿主，從鴨的腫瘤病

2、料中可以分離出REV。REV代表株中有兩株來源于鴨，即鴨脾壞死病毒(SNV)和鴨傳染性貧血病毒(DIAV)。但在我國，除了疫苗污染外，還沒有關(guān)于鴨群中REV自然感染狀態(tài)的報(bào)道。 本課題利用REVenv基因的保守序列，用地高辛標(biāo)記核酸探針。從山東省不同地區(qū)不同日齡鴨群中采集法氏囊、脾臟、肝臟樣品，通過組織DNA直接點(diǎn)雜交，常規(guī)PCR、巢式PCR檢測REV核酸，并用組織勻漿接種CEF，培養(yǎng)分離病毒，IFA檢測，完成了鴨群中REV感染

3、的流行病學(xué)調(diào)查。從不同地區(qū)nest-PCR陽性產(chǎn)物中隨機(jī)選擇克隆測序，做同源性和進(jìn)化樹分析，從核酸親緣關(guān)系上推測鴨群中REV的來源。 實(shí)驗(yàn)一REV核酸探針檢測方法的建立以經(jīng)典鴨源SNV株前病毒全基因組cDNA的感染性克隆質(zhì)粒pB101DNA為模板，用REV特異性引物擴(kuò)增env基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證無誤后，回收、純化、定量，用地高辛標(biāo)記，制備出地高辛標(biāo)記的核酸探針。該探針能與感染REV的細(xì)胞、組織提取的DNA發(fā)生特異性雜交

4、。核酸探針敏感性和特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示：該探針能檢測到1pg特異性核酸，具有很高的靈敏度和特異性。該研究為REV的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了良好的方法。 實(shí)驗(yàn)二鴨群中REV感染的流行病學(xué)調(diào)查隨機(jī)采集來自山東省不同地區(qū)97只鴨組織樣品220份，以提取的組織DNA為模板進(jìn)行特異性斑點(diǎn)雜交、PCR和nest-PCR檢測。用nest-PCR從其中121份組織DNA中檢出REV特異性核酸，陽性率為55％，這說明山東省已有相當(dāng)部分的鴨群感染或感

5、染過REV。這是國內(nèi)首次對鴨群中REV感染狀態(tài)的流行病學(xué)報(bào)道。對上述樣品同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、點(diǎn)雜交和常規(guī)PCR檢測，但均為陰性。這與從雞體內(nèi)很容易檢測或分離到REV顯著不同，說明REV在感染鴨體內(nèi)病毒含量很低，或前病毒DNA與鴨基因組發(fā)生整合的機(jī)率比雞低。本實(shí)驗(yàn)對肝臟、脾臟、法氏囊檢出率的分析比較發(fā)現(xiàn)，法氏囊的檢出率明顯高于肝臟和脾臟，差異極顯著(P＜0.01)。因此，今后在檢測鴨群的感染時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對法氏囊的檢測。 實(shí)驗(yàn)三

6、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒囊膜糖蛋白基因的克隆及序列分析REV基因序列相對保守，無明顯高變區(qū)，但囊膜糖蛋白基因(env)較REV其他結(jié)構(gòu)基因如gag、pol較易發(fā)生變異，也是決定病毒抗原性的主要基因，因此我們選擇env作為檢測基因。通過三個(gè)地區(qū)樣品REVenv基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，YN-1株、BZ-1株核酸序列與美國分離的經(jīng)典鴨源SNV株同源性最高，LQ-1株與美國雞源分離株同源性最商，而均與中國雞源REV分離株的同源性相對較低。進(jìn)化樹分析