丹酚酸抗氧化活性標(biāo)識(shí)及對(duì)組織損傷保護(hù)作用.pdf

1、丹酚酸是一大類(lèi)植物多酚化學(xué)物，在唇形科鼠尾草屬(Salvia L.)植物中含量豐富。研究表明，丹酚酸在活血化瘀、增加冠脈血流量、抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面有顯著生物活性，對(duì)缺血和缺血再灌注引起的損傷有保護(hù)作用，丹酚酸的生物活性及功效已越來(lái)越受到人們的重視。但是，由于丹酚酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)多、結(jié)構(gòu)相似而繁雜、數(shù)量消長(zhǎng)缺乏規(guī)律性等原因，給這類(lèi)物質(zhì)的高通量活性篩選及作用機(jī)制研究帶來(lái)了很大困難。 氧化性損傷是導(dǎo)致所有血管相關(guān)性疾病共同的作用機(jī)制?；?/p>

2、于對(duì)丹酚酸多羥基結(jié)構(gòu)的分析，我們推測(cè)抗氧化活性可能是其具有多種生理作用的主要機(jī)制之一。本課題以丹酚酸為代表，對(duì)丹酚酸成分進(jìn)行分離及表征，探討丹酚酸的體內(nèi)、體外的抗氧化能力，并利用高效液相色譜(HPLC)構(gòu)建了植物多酚抗氧化活性高通量標(biāo)識(shí)技術(shù)，對(duì)丹酚酸保護(hù)組織氧化性損傷的作用途徑進(jìn)行了初步探討。為多酚類(lèi)植物化學(xué)物高通量活性篩選研究提供了一種嶄新的技術(shù)方法，為進(jìn)一步研究丹酚酸對(duì)血管相關(guān)性疾病的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 目的：探討丹酚酸抗氧

3、化活性作用機(jī)制及其與組織氧化損傷保護(hù)之間的關(guān)系，構(gòu)建植物多酚在線抗氧化活性高通量篩選技術(shù)，為研究丹酚酸對(duì)血管相關(guān)性疾病的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并開(kāi)拓植物化學(xué)物分析新方法。 方法：選用丹酚酸含量豐富的鼠尾草屬植物丹參為原料，采用溶劑萃取、大孔吸附樹(shù)脂純化等技術(shù)分離以獲得不同種類(lèi)和含量的丹酚酸，并以標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行表征。采用清除二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)自由基、還原能力、亞鐵離子的螯合能力、對(duì)β-胡蘿卜素的漂

4、白能力以及鄰啡羅啉(Plaen)-Cu-AscA-H<,2>O<,2>-DNA體外化學(xué)發(fā)光體系5種體外抗氧化反應(yīng)模型綜合評(píng)價(jià)丹酚酸的抗氧化能力和對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上建立大鼠急性肝損傷模型，研究丹酚酸在體內(nèi)對(duì)氧化損傷組織的保護(hù)作用。以HPLC為手段，通過(guò)引入DPPH有機(jī)自由基與丹酚酸發(fā)生在線清除反應(yīng)，發(fā)展抗氧化活性標(biāo)識(shí)技術(shù)；HPLC定量測(cè)定丹酚酸作為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)的活性，研究活性氧(RDS)產(chǎn)生與丹酚

5、酸生物活性的關(guān)系。 結(jié)果： 1．從鼠尾草植物丹參的根部獲得3種不同組成和純度的丹酚酸AE、EE和RE，得率分別為73.2％、3.6％、2.2％。各丹酚酸在4℃干燥條件下保存，性狀穩(wěn)定，粉末性良好。在本實(shí)驗(yàn)條件下，3種丹酚酸HPLC色譜圖中呈現(xiàn)8個(gè)共有峰，其中3個(gè)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照丹參素(DSS)、咖啡酸(CA)、丹酚酸B(Sal B)所確認(rèn)，Sal B含量分別為5.60％、74.38％和90.45％。丹酚酸水溶液在80℃和90℃

6、下加熱120min后，和在60℃相同時(shí)間下的加熱相比， Sal B的含量有較大幅度的下降(p<0.05)，但在pH3條件下的熱處理組Sal B含量沒(méi)有顯著變化。 2.在本實(shí)驗(yàn)采用的5種模型中，丹酚酸均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化能力。丹酚酸AE、EE和RE在濃度為100μg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除活性(％)分別為35.87±0.34、88.55±0.12、89.48±0.12；還原能力(以吸光度表示)分別為0.106±0.00

7、15、0.7624.±0.0053、0.8016±0.0076；對(duì)亞鐵離子鰲合能力(％)分別為2.08±0.05、1.28±0.22、0.39±0.03；對(duì)β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液的漂白能力(％)分別為2.63±0.09、8.73±1.74、14.47±2.19;AE、EE、RE對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)能力的IC50分別為1293.6、62.0、49.2μh/mL。其中，對(duì)DPPH自由基清除能力、還原能力、對(duì)β-胡蘿卜素的漂白能力以及對(duì)

8、羥自由基損傷DNA的保護(hù)作用均與濃度在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。相關(guān)性分析顯示丹酚酸中Sal B含量和還原能力的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9644，其次為對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用，r為0.9012。 3.丹酚酸對(duì)大鼠急性肝損傷模型的保護(hù)作用結(jié)果顯示，與CCl<,4>組相比，丹酚酸RE能明顯降低大鼠血清AST、ALT的含量(p<0.05)，各丹酚酸RE組大鼠血清和肝組織的SOD活性活力上升，MDA含量降低，GSH含量升高(p<

9、0.05)，能減輕肝組織的病理改變。 4.本實(shí)驗(yàn)以丹酚酸為例，構(gòu)建了植物化學(xué)物在線清除自由基活性指紋標(biāo)識(shí)技術(shù)，該技術(shù)能夠在不需分離制備情況下，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)、篩選抗氧化植物化學(xué)物先導(dǎo)成分。結(jié)果一次性獲得13種丹酚酸清除DPPH自由基活性，隨著丹酚酸濃度的增高，各丹酚酸對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增大。其中出峰時(shí)間在55.8min的sal B清除自由基的能力最高，其后依次為SA8>SA6>SA12>SA5>SA1。 5.采

10、用HPLC定量測(cè)定丹酚酸的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)活性結(jié)果顯示：建立的色譜條件下，可通過(guò)測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)水解馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu)后產(chǎn)生的馬尿酸的量獲得丹酚酸的ACEI活性。香丹注射液(以丹酚酸為主成分)和丹酚酸EE對(duì)ACE有明顯的抑制作用，香丹注射液濃度為原注射液的1/8時(shí)，抑制活性達(dá)到39.95％，丹酚酸EE濃度在1mg/nL時(shí)，抑制活性為31.44％，隨著各自濃度的上升，其ACEI

11、活性逐漸增加，有一定的量效關(guān)系。DSS、CA、原兒茶醛、Sal B在濃度為1mg/mL，時(shí)， ACEI活性分別為94.70％、62.26％、49.39％、23.14％。 結(jié)論：建立的HPLC條件，能對(duì)丹酚酸的不同組分進(jìn)行標(biāo)識(shí)和表征。在采用的反應(yīng)體系中，丹酚酸表現(xiàn)出不同程度的抗氧化能力，對(duì)DNA損傷具有保護(hù)作用。Sal B可能是丹酚酸中的主要抗氧化物質(zhì)。丹酚酸抗氧化途徑主要是通過(guò)酚羥基提供氫質(zhì)子，破壞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程。通過(guò)抑制D

12、NA鏈的斷裂并延遲其受損時(shí)間，從而消除羥自由基對(duì)DNA的攻擊損傷。體內(nèi)氧化損傷模型研究表明，丹酚酸可提高實(shí)驗(yàn)性大鼠機(jī)體抗氧化能力，減輕CCl<,4>對(duì)機(jī)體造成的急性肝損傷，丹酚酸對(duì)氧化損傷的肝組織具有一定保護(hù)作用。 通過(guò)HPLC-DPPH在線標(biāo)識(shí)技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多組分丹酚酸抗氧化能力的同時(shí)綜合研究。不同丹酚酸物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除的活性各不相同，Sal B是丹酚酸中活性最高的物質(zhì)。丹酚酸ACEI活性研究及特征標(biāo)識(shí)結(jié)果提示，丹酚