轉(zhuǎn)染Akt1基因?qū)θ毖鯊?fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞的抗凋亡作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過重組慢病毒表達(dá)載體攜帶蛋白激酶B(Akt1)基因感染乳鼠心肌細(xì)胞，將心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模擬缺血再灌注損傷，探討Akt1基因?qū)π募〖?xì)胞缺血再灌注損傷的抗凋亡作用及此作用與鈉鈣交換蛋白1(NCX1)的關(guān)系。
　　方法：1.采用本實(shí)驗室前期方法分離和培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞，并進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)染，利用表達(dá)載體pLVX-EGFP-3FLAG中帶有的EGFP報告基因，對感染效率進(jìn)行監(jiān)測。2.建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型模擬心肌缺血再灌注損傷，

2、通過MTT和TUNEL法檢測轉(zhuǎn)染Akt1基因?qū)θ毖鯊?fù)氧乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。3.通過RT-PCR和Western blot檢測Akt1與NCX1的關(guān)系。實(shí)驗方法分組如下:首先分五組:①正常對照組（C組）;②缺氧復(fù)氧組(HR組）;③空載體組(CV組);④Akt1基因轉(zhuǎn)染組（A組）;⑤Akt1抑制劑LY294002組（LY組），通過MTT法檢測心肌細(xì)胞活性，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞的凋亡來驗證Akt1對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。然后外加兩組:⑥

3、NCX1逆向轉(zhuǎn)運(yùn)模式抑制劑KB-R7943組(K組）;⑦基因轉(zhuǎn)染+KB-R7943組（A+K組），使用RT-PCR檢測Akt1和NCX1的mRNA水平變化，Western blot檢測Akt1、P-Akt1、NCX1及線粒體凋亡途徑相關(guān)凋亡蛋白細(xì)胞色素C和caspase-9蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.培養(yǎng)出純度＞95％的乳鼠心肌細(xì)胞，向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組慢病毒LV-Akt1，24h心肌細(xì)胞綠色熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)，至48h熒光表達(dá)率及強(qiáng)

4、度穩(wěn)定，檢測慢病毒LV-Akt1的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為25。2.MTT及TUNEL檢測結(jié)果顯示:與C組相比，HR組心肌細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率增高(p＜0.05)，但轉(zhuǎn)染Akt1后（A組）可以增加心肌細(xì)胞活力和降低心肌細(xì)胞凋亡率(p＜0.05)。LY組與CV組對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞活力及凋亡率無明顯影響(p＞0.05)。3.RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示:與C組相比，HR組心肌細(xì)胞Akt1和NCX1的mRNA水平及蛋

5、白水平都無明顯改變(p＞0.05)，凋亡蛋白的量明顯增加(p＜0.05)。但轉(zhuǎn)染Akt1基因后（A組），Akt1的mRNA水平和蛋白水平升高(p＜0.05)，NCX1mRNA水平和蛋白水平反而是降低的(p＜0.05)，同時凋亡蛋白的量也有所下降(p＜0.05).LY組和CV組與HR組相比對二者mRNA水平和蛋白水平都無明顯影響(p＞0.05)，LY組可以降低缺氧復(fù)氧時P-Akt1蛋白表達(dá)(p＜0.05)，但對凋亡蛋白影響不大(p＞0.0