環(huán)孢菌素A-納米乳增強脂肪組織來源干細胞移植治療小型豬急性心肌梗死療效研究.pdf

1、背景：干細胞移植到心臟受心肌梗死后惡劣微環(huán)境影響，導致細胞大量凋亡甚至死亡。因此，如何提高干細胞移植成活率就成為干細胞治療領域最大的挑戰(zhàn)。環(huán)孢菌素(CsA)是臨床廣泛應用的高效免疫抑制劑。近年來研究發(fā)現(xiàn),環(huán)孢菌素A能抑制細胞凋亡，因而得以在心血管領域應用。然而長期應用環(huán)孢菌素A可能帶來的肝、腎毒性卻限制了該藥在臨床的大規(guī)模應用。借鑒腫瘤化療藥物的靶向遞藥的成功經驗，我們制造并評估了負載環(huán)孢菌素A的納米乳(CsA-NP)。由于納米微粒能修

2、飾藥物在體內的重新分布，因而有望達到靶向、高效、低毒的療效。
　　目的：因此，本項研究將評估CsA-NP是否能增強脂肪組織來源干細胞(ASCs)移植治療小型豬急性心肌梗死療效及可能機制。
　　方法：第一部分：CsA-NP采用高壓均質法制備而成。采用高效液相色譜法(HPLC)評估產品的載藥率，乳徑的粒徑經激光粒度分析儀測定。
　　第二部分：評估CsA-NP在體外對ASCs增殖和分化的影響。提取小型豬腹股溝脂肪組織經分離、

3、培養(yǎng)和擴增。ASCs表面標記物經流式細胞儀檢測鑒定。ASCs增殖和分化采用細胞直接計數(shù)和MTT檢測。
　　第三部分：評估CsA-NP保護ASCs抗凋亡作用及可能機制。采用過氧化氫（H2O2）體外誘導ASCs凋亡模型,Annexin-VFITC/PI雙染流式細胞術檢測ASCs細胞凋亡,細胞活性和Caspase-3活性檢測分別采用CCK-8試劑Caspase-3試劑，cytochromec的表達采用Westernblot分析。

4、　　第四部分：延遲增強核磁共振（DE-MRI）評估經皮球囊封堵冠狀動脈法制備小型豬急性心肌梗死模型。
　　第五部分：17頭AMI后存活的小型豬分為四組：control組(n=5)；CsA-NP組,（n=4);ASCs組（n=4);ASCs和CsA-NP聯(lián)合移植組(CsA-NP+ASCs組,n=4)。AMI后1周經冠脈內注入ASCs或PBS。干細胞移植前和干細胞移植后8周，DE-MRI評估心臟結構和功能。病理組化評估移植后心肌和移植

5、細胞情況。
　　結果：第一部分：本研究制備的CsA-NP工藝穩(wěn)定性好，粒徑均勻，50％的乳滴微粒直徑在162nm以內。
　　第二部分：檢測結果提示ASCs分子表型CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈陰性表達。CsA-NP濃度在（0.01-1mg/ml）之間對細胞增殖有明顯促進作用（P<0.01）;其中又以0.5mg/ml的CsA-NP劑量組為最佳。5mg/ml

6、以上對細胞增殖幾乎沒有影響。
　　第三部分：細胞形態(tài)（細胞皺縮、凋亡小體形成和DNA片段化）和生化結果檢測顯示H2O2能誘導ASCs凋亡,但CsA-NP(0.1-10mg/ml)作用24小時后能抑制H2O2誘導的ASCs凋亡，其中又以5mg/ml濃度組為最佳（P<0.001）。H2O2誘導的ASCs線粒體內跨膜電位坍塌可部分被CsA-NP(0.1-10mg/ml)抑制。CsA-NP(0.1-10mg/ml)可下調caspase-3

7、活性，而且Western-blot結果顯示CsA-NP(5mg/ml)可完全抑制H2O2誘導的cytochromeC釋放。
　　第四部分：有17只小型豬心肌梗死造模后存活，成功率54.8%(17/31)。MRI顯示心肌梗死面積為10.2±2.9(cm3)。與對照組比較，AMI組CO、LVEF和SV均明顯下降(P<0.001)；而LVEDV和LVESV均升高（P<0.05）。DE-MRI與后期的左室短軸病理切片結果相呼應。
　

8、　第五部分：與對照組比較，ASCs和CsA-NP+ASCs組的LVEDV、LVESV升高顯著(P<0.05)。與CsA-NP和ASCs組比較，CsA-NP+ASCs組的LVEF提升尤其明顯(P<0.01)，而梗死面積和室壁厚度下降顯著，梗死中心和梗死邊緣的血管增生明顯(P<0.01)，而其它三組無顯著性差異。與ASCs組比較，CsA-NP+ASCs組DAPI和免疫熒光顯示心肌表面標記物α-actin,cTn-T,vWF分化顯著增多(P<

9、0.01)。Masson纖維染色顯示ASCs和CsA-NP+ASCs組的纖維增生顯著下降(分別為P<0.05,P<0.01)。TUNEL顯示ASCs和CsA-NP+ASCs組心肌細胞凋亡明顯減輕(分別為P<0.05,P<0.01)。CsA-NP+ASCs和CsA組caspase-3和cytochromeC水平顯著下降(P<0.05)。
　　結論：CsA-NP增強了ASCs移植治療小型豬AMI療效，改善了左室重構，提高了心功能。心功