飯豆VuFDH1和VuNAC1調(diào)控鋁脅迫響應(yīng)的分子生理機(jī)制研究.pdf

1、鋁毒害是酸性土壤上限制作物生產(chǎn)的主要因子。飯豆是起源于熱帶、亞熱帶地區(qū)的一種長期適應(yīng)酸鋁土壤的農(nóng)作物，是研究作物酸鋁適應(yīng)機(jī)制的理想材料之一。我們課題組已經(jīng)利用抑制差減文庫(SSH)技術(shù)構(gòu)建了飯豆在低濃度和高濃度鋁脅迫下的早期響應(yīng)的文庫，發(fā)現(xiàn)其中‘信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄’以及‘代謝與能量’相關(guān)的基因被優(yōu)勢上調(diào)表達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄因子VuNACl(Vigna umbellata NAM，ATAF and CUC transcription factor1

2、)和甲酸脫氫酶代謝基因VuFDHl(FormateDehydrogenase)等在飯豆應(yīng)答低濃度和高濃度鋁脅迫時有較明顯的上調(diào)。因此，我們對這些基因進(jìn)行了耐鋁功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)VuNA C1和VuFDH1這兩個基因的轉(zhuǎn)基因株系具有較明顯的耐鋁表型，因此我們對這兩個基因進(jìn)行了更為深入的研究，以期進(jìn)一步闡明酸性土壤植物的耐酸鋁機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該基因全長cDNA序列，并通過GenomeWal

3、king技術(shù)獲得了啟動子序列。底物特異性分析表明VuFDH1對甲酸鹽具有底物特異性，具有甲酸脫氫酶活性。qRT-PCR以及組織定位分析表明VuFDH1在根尖受Al及H+脅迫后顯著性上調(diào)。通過in silico預(yù)測以及in plantaVuFDHl-GFP融合基因過表達(dá)擬南芥株系證明了VuFDH1定位在線粒體。進(jìn)一步研究表明，Al脅迫下飯豆根尖甲酸鹽迅速累積（2小時之內(nèi)），之后一直維持在較高累積水平。這些結(jié)果表明甲酸鹽的產(chǎn)生可能參與了Al

4、誘導(dǎo)的根尖伸長的抑制。隨后，我們通過轉(zhuǎn)基因株系研究了飯豆甲酸脫氫酶在H+以及鋁耐性中的作用。與野生型煙草相比，VuFDH1過表達(dá)煙草增加了其對Al及H+脅迫的耐性。Al脅迫后，野生型煙草根尖甲酸鹽含量升高而VuFDH1過表達(dá)煙草株系根尖甲酸鹽含量變化不明顯。煙草兩個主要耐鋁基因NtMA TE和NtALS3在野生型以及VuFDH1過表達(dá)煙草株系之間沒有顯著性差異。這些結(jié)果表明，VuFDH1影響飯豆對Al的耐性主要是通過降低Al誘導(dǎo)的甲酸鹽

5、含量來實(shí)現(xiàn)的。我們的研究結(jié)果為Al毒害和H+脅迫共存的酸性土壤上的植物的生長的促進(jìn)提供了一條新的參考途徑。
　　(2)通過RACE技術(shù)擴(kuò)增得到該基因全長cDNA，并通過Genome Walking技術(shù)獲得了啟動子序列。qRT-PCR分析表明VuNA C1在飯豆根尖受Al脅迫后顯著性上調(diào)。VuNA C1在飯豆根尖的表達(dá)是Al處理時間和Al濃度梯度依賴的。超表達(dá)VuNAC l-GFP融合基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系GFP熒光定位分析表明Vu

6、NAC1定位在細(xì)胞核。酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)表明該基因具有轉(zhuǎn)錄活性。組織定位分析表明VuNAC1在根尖受Al脅迫后表達(dá)量增加。與野生型擬南芥相比，VuNA C1過表達(dá)擬南芥株系增加了其對Al脅迫的耐性。進(jìn)一步研究了過表達(dá)VuNA C1對一系列Al耐性基因的影響，結(jié)果表明一些重要的鋁耐性響應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄均不受Vu NA C1的影響或者影響不顯著。此外，過表達(dá)VuNAC1也沒有增加植株的蘋果酸分泌以及減少根部Al的含量。這些結(jié)果表明，VuNA

7、C1提高植株對Al的耐性不是通過影響已知的耐鋁機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。我們進(jìn)一步對擬南芥WT和VuNA C1過表達(dá)株系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。比較研究發(fā)現(xiàn)，與WT相比Al處理后VuNA C1過表達(dá)株系中分別有128個上調(diào)基因和69個下調(diào)基因是VuNA C1過表達(dá)株系所特有的。我們發(fā)現(xiàn)這些特有上調(diào)表達(dá)基因的啟動上具有較多的NAC順式作用元件，有些還以串聯(lián)的形式出現(xiàn)。對這些特異表達(dá)基因的GO功能歸類發(fā)現(xiàn)了一類細(xì)胞壁相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)尤其明顯，同時發(fā)現(xiàn)VuN