亞洲玉米螟整合素在血細(xì)胞包囊外源物過(guò)程中的功能研究.pdf

1、本研究在已經(jīng)克隆得到亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)Integrinβ1cDNA(命名為Ofintβ1)全長(zhǎng)序列的基礎(chǔ)上，以亞洲玉米螟幼蟲為試蟲，初步分析了Ofintβ1的組織分布及其在調(diào)控漿細(xì)胞形態(tài)變化及血細(xì)胞包囊外源物過(guò)程中的作用。 為在蛋白水平上對(duì)Ofintβ1進(jìn)行檢測(cè)，克隆了胞外域靠近5’端一個(gè)408bp的cDNA片段(aa＃174-309)，其中包含一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)(aa＃173-177)。將Ofin

2、tβ1片段連接到表達(dá)載體pET-32a上，陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行了高效表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)表明Ofintβ1在大腸桿菌中可表達(dá)分子量約為27.6kDa的可溶性融合蛋白，Westernblot分析表明表達(dá)產(chǎn)物能與抗6His單抗特異性結(jié)合，即表達(dá)的OfINTβ1為C端帶有6His標(biāo)簽的融合蛋白。將經(jīng)Ni-NTA親和柱純化的OflNTβ1融合蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了抗OfINTβ1

3、的兔血清(命名為Anti-OfINTβ1)，ELISA效價(jià)達(dá)12800以上。Western印跡檢測(cè)結(jié)果表明，制備的抗血清可以特異識(shí)別表達(dá)的融合蛋白OfINTβ1。 為檢測(cè)Ofintβ1的組織表達(dá)差異性，提取了亞洲玉米螟5齡中期幼蟲的血細(xì)胞、腦、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管、氣管7個(gè)組織的總RNA，利用RT-PCR進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平上的檢測(cè)，結(jié)果只在血細(xì)胞中檢測(cè)到Ofintβ1的特異性表達(dá)帶，而在其它組織中未檢測(cè)到該基因轉(zhuǎn)錄本的存在。不

4、同組織的Westernblot分析表明，誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的血細(xì)胞蛋白粗提液中均有OfINTβ1表達(dá)。血細(xì)胞免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，Anti-OfINTβ1可以與血細(xì)胞特異性結(jié)合。 用不同稀釋倍數(shù)的抗OflNTβ1兔血清封閉細(xì)胞表面表達(dá)的OfINTβ1蛋白，結(jié)果表明血細(xì)胞對(duì)載玻片的粘附能力因抗血清濃度的不同而不同。粘附30min后，2倍稀釋的抗血清封閉的血細(xì)胞有明顯的聚集，很難觀察到血細(xì)胞粘附能力的變化；5倍與10倍稀釋的抗血清封

5、閉的漿細(xì)胞對(duì)載玻片的粘附能力受到明顯抑制；而100倍稀釋的抗血清對(duì)漿細(xì)胞的黏附能力無(wú)明顯抑制作用，血細(xì)胞的狀態(tài)與對(duì)照血清及Pringle’ssaline處理的結(jié)果基本相同。說(shuō)明OflNTβ1在調(diào)控漿細(xì)胞形態(tài)變化和血細(xì)胞粘附過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。 為進(jìn)一步分析Ofintβ1在血細(xì)胞包囊外源物過(guò)程中的功能，使用了RNA干擾的方法。首先，構(gòu)建了重組載體L4440-Ofintβ1，在大腸桿菌HT115(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA，以期通