Leptin-AMPKα2-BSEP調(diào)控的膽汁酸代謝在膽石形成中的作用研究.pdf

1、目的:膽石癥（cholelithiasis）的病因包括膽汁代謝異常和感染。在致石性膽汁研究中，膽汁中膽汁酸含量減少是促石形成的重要因素。膽鹽輸出泵(Bile Salt Export Pump，BSEP)是調(diào)節(jié)膽汁酸排泄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體，其表達(dá)量下降將導(dǎo)致膽汁酸分泌減少、膽汁淤積。而AMPK調(diào)節(jié)BSEP的表達(dá)，受機(jī)體代謝因素的影響。瘦素（Leptin）是機(jī)體調(diào)節(jié)能量代謝的激素之一，可通過(guò)AMPK調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝。本實(shí)驗(yàn)觀察肝臟良性病變患者、膽

2、囊固醇結(jié)石患者、原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者Leptin、AMPKα2、BSEP的mRNA和蛋白表達(dá)量，Leptin/AMPKα2/BSEP信號(hào)通路對(duì)膽汁酸代謝的調(diào)控，初步探討膽石癥患者中膽汁酸代謝調(diào)控機(jī)制，豐富膽石癥的發(fā)病機(jī)理。
　　對(duì)象與方法:1、研究對(duì)象共分為3組，膽囊結(jié)石(Gall Stone，GS)組共30例，原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石（Primary intrahepatic stone，PIS）組共30例，肝臟良性病變（Contr

3、ol，CT）組，該組患者中均無(wú)合并膽道疾病，其中肝血管瘤8例，肝囊腫5例，肝外傷2例，共計(jì)15例。血清樣本的獲得:抽取患者術(shù)前空腹血清，采用放免法檢測(cè)血清瘦素水平，運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總膽汁酸(Total Bile acid，TBA)、總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(Directbilirubin，DBIL)、間接膽紅素(Indirect bilirubin，IBIL)、總膽固醇(Totalc

4、holesterol，TC)、甘油三酯(Triglycerides，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspertate aminotransferase，AST）。肝組織樣本的獲得:經(jīng)倫理委員會(huì)審批授權(quán)，患方知情同意后，采集手術(shù)中切下肝組織后，立即切除適當(dāng)大小裝入預(yù)裝RNA保存液的凍存管中，送瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱凍存。2、采用Real-time Quanti

5、tative PCR方法，以GAPDH為內(nèi)參照，檢測(cè)肝組織中OB-Rb、AMPKα2、 BSEP基因mRNA的表達(dá)量。OB-RB5'primer:GCCTTCATAAGCCTACCAATGTAGA, OB-Rb5'Reverser:GGAAACAAGGGACCTTCCCACTA, AMPKα25'primer:CAGGAGATGCAGTCCAGCACAA, AMPKα25'Reverser:5'GCCCACATCTACCTATCACAT

6、TCAG, BSEP5'primer:TCGCTTGTCCACCATCCAGAA, BSEP5'Reverser:GGGGATCCAGTGGTGACTAGTT。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本PCR反應(yīng)Ct值，用Bio-Rad iQ5軟件分析計(jì)算目的基因的mRNA表達(dá)水平。3、采用Western blot法檢測(cè)肝組織中OB-Rb、AMPKα2、 p-AMPKα2、BSEP蛋白表達(dá)水平:以β-actin為內(nèi)參，抗體1分別選擇Anti-LeptinRec

7、eptor antibody:ab5593, AMPKαAntibody:2532,Phospho-AMPKα:2535，BSEP Antibody(P-18): sc-17294，檢測(cè)上述基因所編碼蛋白表達(dá)量。圖像結(jié)果使用Bio-Rad凝膠攝像分析系統(tǒng)及Quantity One4.4.0軟件分析計(jì)算相關(guān)蛋白的表達(dá)量。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組均數(shù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩

8、兩比較采用最小差異t檢驗(yàn)(LSD-t)，若方差不齊，采用Dunnett's T3檢驗(yàn)，組間三者比較采取秩和檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.血清相關(guān)指標(biāo)分析:血清中Leptin在各組中均有一定的變化，同CT組（5.66±4.41μg/L）和PIS組(4.87±3.66μg/L)比較，GS組（8.66±4.4μg/L）血清Leptin水平顯著升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。然而，同GS組（8.66±

9、4.4μg/L）比較，PIS組（4.87±3.66μg/L）血清Leptin水平顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同CT組(4.35±0.84mmol/L,1.51±1.2mmol/L)和PIS組（4.5±1.73mmol/L，1.37±0.88mmol/L）比較，GS組血清總膽固醇（4.74±1.12mmol/L）、甘油三酯（1.96±1.84mmol/L）水平雖有升高趨勢(shì)，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同CT組和

10、GS組比較，PIS組總膽汁酸（20.88±33.25μmol/L）、總膽紅素（42.19±59.93μmol/L）、直接膽紅素（25.9±45.51μmol/L）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(60.21±57.3 U/L)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(75.01±79.05 U/L)均顯著升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。2.同CT組(1)比較，GS組(0.857)、PIS組(0.612) OB-Rb基因mRNA表達(dá)量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.

11、05）;同CT組(1)比較，GS組(0.889)、PIS組(0.567) AMPKα2基因mRNA表達(dá)量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;同CT組(1)比較，GS組(0.847)、PIS組(0.687) BSEP基因mRNA表達(dá)量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3.同CT組（1±0.67）比較，GS組（0.19±0.08）、PIS（0.14±0.02）組OB-RB基因蛋白表達(dá)量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

12、（P＜0.05）;同CT組（1±0.83）比較，GS組（0.09±0.38）、PIS組（0.13±0.12）AMPKα2基因蛋白表達(dá)量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;同CT組（8.95±3.29）比較，GS組（1.74±0.52）、PIS組（1.01±0.66）p-AMPKα2基因蛋白表達(dá)量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;同CT組（8.95±3.29）比較，GS組(1.74±0.52)、PIS組(1.01

13、±0.66)BSEP基因蛋白表達(dá)量顯著降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:1.PIS組患者血清TBA、TBIL、DBIL、ALT、AST明顯高于GS組和CT組，提示原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者有膽道梗阻，可能存在膽汁酸排泄障礙。2.GS患者血清瘦素升高，但肝臟組織中OB-Rb以及AMPKα2、p-AMPKα2、BSEP基因的mRNA和蛋白表達(dá)下降。提示GS患者存在一定程度的瘦素抵抗，膽石的形成與Leptin/AMPK