水中病毒膜吸附洗脫和免疫磁珠吸附法研究.pdf

1、目的：(1)優(yōu)化濾膜吸附-洗脫法富集水體病毒的反應(yīng)條件，以便有效富集水體病毒(2)制備脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體，構(gòu)建免疫磁珠，探討免疫磁珠捕獲法富集水體病毒的可行性。
　　 方法：(1)采用膜吸附洗脫法初次濃縮水體病毒，調(diào)節(jié)水樣pH 值和Al 3+濃度，比較不同pH 值、有無金屬陽離子情況下，水體中病毒的回收率，根據(jù)回收率高低選擇最佳條件進行病毒富集。(2)采用聚乙二醇（PEG）6000 沉淀法二次濃縮水體病毒，配制不同濃度的P

2、EG6000 溶液，比較各濃度下病毒回收率的高低，選擇合適濃度進行病毒二次濃縮。(3)將不同濾膜和不同洗脫液組合進行序貫試驗，比較各組合回收率，選擇最佳組合進行病毒富集。(4)用純化的脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原免疫日本大白兔，皮下多點注射，制備脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體，間接ELISA法測定抗體效價，核酸蛋白儀測定抗體濃度。將制備的脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體與微磁珠偶聯(lián)構(gòu)建免疫磁珠，富集水體病毒，實時定量PCR法檢測病毒回收量，計算病毒回收率，評價

3、免疫磁珠捕獲法對病毒的吸附效果。
　　 結(jié)果：(1)pH=4.0時，病毒回收率為70.81%，較其他pH 值高；加AlCl3的病毒回收率76.73%較不加AlCl3的55.51%高；病毒回收率隨PEG6000 濃度增加而增大，PEG6000 濃度在120g/l時，病毒回收率可達85.90%，繼續(xù)增加PEG6000 濃度，病毒回收率變化不明顯；將混合纖維素酯濾膜和H2SO4/NaOH 洗脫液組合，病毒回收率為75.17%，病毒富集

4、效果較其他組合好。(2)純化后抗體效價為1：8000，抗體濃度12.87mg/ml，用純化的抗體包被空白磁珠，空白磁珠對脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體的飽和吸附量為143.5 μg/mg，將制備的免疫磁珠加入到不同濃度脊髓灰質(zhì)炎病毒液中，在100 倍稀釋的病毒液中可回收63.67%。
　　 結(jié)論：(1)水體中加入多價金屬陽離子可增加病毒回收率；不同pH條件下，病毒回收率不同，pH=4.0時，病毒回收率最高；混合纖維素酯濾膜吸附，H2S

5、O4/NaOH洗脫液洗脫，病毒富集效果好；增加PEG6000 濃度可提高病毒回收率，當(dāng)PEG6000 濃度在120g/l時，病毒回收率可達85%以上，效果較好。(2)成功制備脊髓灰質(zhì)炎病毒多克隆抗體，效價較高；抗體包被磁珠效果并不理想，尚不清楚是由磁珠氨基化修飾或抗體偶聯(lián)哪一過程引起。最后將免疫磁珠應(yīng)用到水體病毒富集中，雖然效果不及膜吸附洗脫法，但回收率尚可，本過程未考慮磁珠濃度、病毒濃度、水體pH 值、水中有機干擾物等對病毒回收率的影